Summary

Mediante genética inversa para manipular el gen de Sociedades Nacionales del virus de la fiebre de Rift Valley MP-12 Cepa para mejorar la seguridad de la vacuna y la eficacia

Published: November 01, 2011
doi:

Summary

A la inversa sistema de genética de la cepa del virus de la fiebre del Valle del Rift MP-12 vacuna es una herramienta útil para la creación de nuevas MP-12 mutantes con mayor atenuación e inmunogenicidad. Se describe el protocolo para la generación y caracterización de cepas mutantes Sociedades Nacionales.

Abstract

Valle del Rift virus de la fiebre (RVFV), que causa la fiebre hemorrágica, trastornos neurológicos o ceguera en los seres humanos, y una alta tasa de aborto y de malformaciones fetales en los rumiantes 1, ha sido clasificado como HHS / USDA se superponen agente de seleccionar un agente patógeno y el nivel 3. Pertenece al género Phlebovirus de la familia Bunyaviridae, y es uno de los miembros más virulenta de esta familia. Varios sistemas de genética inversa para la cepa RVFV MP-12 2,3 vacuna, así como las cepas salvajes RVFV 4-6, incluyendo ZH548 y ZH501, se han desarrollado desde el año 2006. El MP-12 cepa (que es un grupo de riesgo 2 y un agente patógeno no seleccionar) está muy atenuado por varias mutaciones en su M y L-segmentos, pero todavía lleva virulenta S-segmento de ARN 3, que codifica una virulencia funcional factor, NSS. El rMP12-C13type (C13type) la realización de 69% en el marco de la eliminación de Sociedades Nacionales ORF carece de todas las funciones conocidas Sociedades Nacionales, al mismo tiempo que se replica como eficient al igual que el MP-12 en células que carecen de VeroE6 tipo I IFN. Sociedades Nacionales induce una desconexión de la transcripción de host, entre ellos el interferón (IFN) beta-ARNm 7,8 y promueve la degradación de la doble hélice de proteína quinasa dependiente de ARN (PKR) en el nivel post-traduccional 9,10. IFN-beta es transcripcionalmente regulado al alza por el interferón factor regulador 3 (IRF-3), NF-kB y la proteína activadora-1 (AP-1), y la unión de IFN-beta de IFN-alpha/beta receptor (IFNAR) estimula la transcripción de IFN-alfa genes u otros genes de interferón estimulado (ISGs) 11, lo que induce a las actividades de acogida antiviral, mientras que la supresión de acogida transcripción incluyendo IFN-beta de genes por Sociedades Nacionales evita que el gen de los upregulations ISGs en respuesta a la replicación viral a pesar de la FIC-3, NF-kB y activador proteína-1 (AP-1) puede ser activada por RVFV7. . Por lo tanto, NSS es un excelente objetivo para atenuar aún más MP-12, y para mejorar las respuestas inmunitarias del huésped natural por la abolición de la función de supresión de IFN-beta. Aquí, Se describe un protocolo para la generación de una proteína recombinante MP-12 Sociedades Nacionales de codificación mutado, y proporcionar un ejemplo de un método de cribado para identificar mutantes que carecen de Sociedades Nacionales de la función de reprimir IFN-beta síntesis de ARNm. Además de su papel esencial en la inmunidad innata, el tipo de IFN-I es importante para la maduración de las células dendríticas y la inducción de una respuesta adaptativa inmune 12-14. Por lo tanto, la inducción de mutantes Sociedades Nacionales de tipo I IFN son más atenuados, pero al mismo tiempo son más eficientes para estimular respuestas inmunes del huésped de tipo salvaje MP-12, que los convierte en candidatos ideales para los enfoques de vacunación.

Protocol

1. Recuperación de MP-12 recombinante mutación Sociedades Nacionales de codificación (s) a partir del plásmido ADN 2 Propagación de riñón de hámster bebé (BHK) / T7-9 celdas 15, que expresan establemente T7 ARN polimerasa, en 6 cm de platos en medio mínimo esencial (MEM)-alfa (Invitrogen, Cat. # 32561037) con 10% de suero fetal bovino (FBS ), penicilina-estreptomicina (penicilina: 100 U / ml, estreptomicina: 100 ug / ml) (Invitrogen, Cat. # 15140122), y 600 mg / ml de higromici…

Discussion

Invertir los sistemas de la genética para RVFV han sido desarrollados por varios grupos mediante la utilización de promotor T7 2,4,5 o ratón de 3 o 4 humanos promotor de Pol-i. En este artículo, se describe un protocolo para generar recombinantes RVFV MP-12 cepas mediante el uso de células BHK/T7-9 15 que expresan establemente T7 ARN polimerasa. La eficiencia de la recuperación viral variado dependiendo de la condición de BHK/T7-9 las células, la cantidad de plásmidos…

Disclosures

The authors have nothing to disclose.

Acknowledgements

Este trabajo fue financiado por la Subvención Número 5 U54 AI057156-07 a través del Centro Regional del Oeste de Excelencia (WRCE), 1 R01-A1 AI08764301 del Instituto Nacional de Alergias y Enfermedades Infecciosas, y un financiamiento interno del Centro Sealy para el Desarrollo de Vacunas de la Universidad de Texas Medical Branch.

Materials

Name of the reagent Company Catalogue number Comments (optional)
Minimum Essential Medium (MEM)-alpha Invitrogen 32561037  
Dulbecco’s modified minimum essential medium Invitrogen 11965092  
Modified Eagle Medium (MEM 2x) Invitrogen 11935046  
Penicillin-Streptomycin Invitrogen 15140122  
Hygromycin B Cellgro 30-240-CR  
Tryptose phosphate broth MP biomedicals 1682149  
Noble agar VWR 101170-362  
TransIT-LT1 Mirus MIR2300  
Opti-MEM Invitrogen 31985070  
Aerosol tight lid Eppendorf C-2223-25  
0.33% neutral red solution Sigma Aldrich N2889-100ML  
C57/WT MEF cells InvivoGen mef-c57wt  
Blasticidin S InvivoGen Ant-bl-1  
Zeocin InvivoGen ant-zn-1  
QUANTI-Blue InvivoGen rep-qb1  
BHK/T7-9 cells15 Gifu university, Japan    
Vero E6 cells ATCC CRL-1586  

References

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Kalveram, B., Lihoradova, O., Indran, S. V., Ikegami, T. Using Reverse Genetics to Manipulate the NSs Gene of the Rift Valley Fever Virus MP-12 Strain to Improve Vaccine Safety and Efficacy. J. Vis. Exp. (57), e3400, doi:10.3791/3400 (2011).

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