Summary

Met behulp van reverse genetics aan de NSS-gen van de Rift Valley Fever virus MP-12 Strain om Vaccine veiligheid en effectiviteit te verbeteren manipuleren

Published: November 01, 2011
doi:

Summary

De reverse genetics systeem voor de Rift Valley koorts virus MP-12 vaccinstam is een handig hulpmiddel voor het creëren van extra MP-12 mutanten met verhoogde verzwakking en immunogeniciteit. We beschrijven het protocol te genereren en karakteriseren NSS mutante stammen.

Abstract

Rift Valley-koorts virus (RVFV), dat hemorragische koorts, neurologische aandoeningen of blindheid bij mensen, en een hoog percentage abortussen en foetale misvormingen bij herkauwers 1 veroorzaakt, is geclassificeerd als een HHS / USDA overlap te selecteren agent en een risico groep 3 ziekteverwekker. Het behoort tot het geslacht Phlebovirus in de familie Bunyaviridae en is een van de meest virulente leden van deze familie. Verschillende reverse genetics systemen voor de RVFV MP-12 vaccinstam 2,3 evenals wild-type stammen RVFV 4-6, waaronder ZH548 en ZH501, zijn ontwikkeld sinds 2006. De MP-12 stam (dat is een risico groep 2 ziekteverwekker en een niet-select agent) is sterk verzwakt door verschillende mutaties in de M-en L-segmenten, maar nog steeds draagt ​​virulente S-segment RNA 3, die een functionele virulentie codeert factor, NSS. De RMP12-C13type (C13type) dragen 69% in-frame verwijderen van NSS ORF mist alle bekende NSS-functies, terwijl het repliceert als efficient doet als MP-12 in VeroE6 cellen ontbreekt type I IFN. NSS induceert een shut-off van gastheer transcriptie waaronder interferon (IFN)-bèta mRNA 7,8 en bevordert de afbraak van double-stranded RNA-afhankelijke proteïne kinase (PKR) op de post-translationele niveau. 9,10 IFN-beta is transcriptioneel opgereguleerd door interferon regulerende factor 3 (IRF-3), NF-kB en activator proteïne-1 (AP-1), en de binding van IFN-beta aan IFN-alpha/beta receptor (IFNAR) stimuleert de transcriptie van IFN-alfa genen of andere interferon gestimuleerde genen (ISGs) 11, welke host antivirale activiteiten induceert, terwijl gastheer transcriptie onderdrukking waaronder IFN-beta-gen door NSS voorkomt dat het gen upregulations van die ISGs in reactie op virale replicatie, hoewel IRF-3, NF-kB en activator proteïne-1 (AP-1) kan geactiveerd worden door RVFV7. . Zo NSS is een uitstekend doelwit verder te verzwakken MP-12 en voor het hosten aangeboren immuunrespons te verhogen door het afschaffen van de IFN-beta onderdrukking functie. HierBeschrijven we een protocol voor het genereren van een recombinant MP-12 codering gemuteerde NSS, en geven een voorbeeld van een screening methode om NSS mutanten die niet over de functie om IFN-beta mRNA-synthese onderdrukken identificeren. In aanvulling op haar essentiële rol in de aangeboren immuniteit, type-I IFN is belangrijk voor de rijping van dendritische cellen en de inductie van een adaptieve immuunrespons 12-14. Zo NSS mutanten het induceren van type I IFN worden verder verzwakt, maar tegelijkertijd efficiënter zijn op het stimuleren gastheer immuunreacties dan wild-type MP-12, waardoor ze ideale kandidaten voor vaccinatie benaderingen.

Protocol

1. Herstel van de recombinant MP-12 codering NSS mutatie (s) van plasmide DNA's 2 Spread baby hamster nier (BHK) / T7-9 cellen 15, die stabiel uitdrukken T7-RNA polymerase, in 6-cm gerechten in Minimum Essential Medium (MEM)-alpha (Invitrogen, Cat # 32561037) met 10% foetaal bovine serum (FBS ), penicilline-streptomycine (Penicilline: 100 U / ml, streptomycine: 100 ug / ml) (Invitrogen, Cat # 15140122), en 600 pg / ml hygromycine B (Cellgro, Cat # 30-240-CR). * De efficiëntie…

Discussion

Reverse genetics voor RVFV zijn ontwikkeld door verschillende groepen door gebruik te maken van T7-promotor 2,4,5 of muis 3 of 4 mensen pol-I promotor. In dit manuscript beschrijven we een protocol om recombinant RVFV MP-12-stammen te genereren door gebruik te maken BHK/T7-9 cellen 15 die stabiel uitdrukken T7 RNA-polymerase. De efficiëntie van virale herstel gevarieerd afhankelijk van de conditie van BHK/T7-9 cellen, de hoogte van plasmiden, het aantal getransfecteerde celle…

Disclosures

The authors have nothing to disclose.

Acknowledgements

Dit werk werd gefinancierd door Grant Nummer 5 U54 AI057156-07 door de Western Regional Center of Excellence (WRCE), een R01 AI08764301-A1 van Nationaal Instituut voor Allergie en Infectieziekten, en een interne financiering van Sealy Center for Vaccine Development aan de Universiteit van Texas Medical Branch.

Materials

Name of the reagent Company Catalogue number Comments (optional)
Minimum Essential Medium (MEM)-alpha Invitrogen 32561037  
Dulbecco’s modified minimum essential medium Invitrogen 11965092  
Modified Eagle Medium (MEM 2x) Invitrogen 11935046  
Penicillin-Streptomycin Invitrogen 15140122  
Hygromycin B Cellgro 30-240-CR  
Tryptose phosphate broth MP biomedicals 1682149  
Noble agar VWR 101170-362  
TransIT-LT1 Mirus MIR2300  
Opti-MEM Invitrogen 31985070  
Aerosol tight lid Eppendorf C-2223-25  
0.33% neutral red solution Sigma Aldrich N2889-100ML  
C57/WT MEF cells InvivoGen mef-c57wt  
Blasticidin S InvivoGen Ant-bl-1  
Zeocin InvivoGen ant-zn-1  
QUANTI-Blue InvivoGen rep-qb1  
BHK/T7-9 cells15 Gifu university, Japan    
Vero E6 cells ATCC CRL-1586  

References

  1. Bird, B. H., Ksiazek, T. G., Nichol, S. T., Maclachlan, N. J. Rift Valley fever virus. J. Am. Vet. Med. Assoc. 234, 883-893 (2009).
  2. Ikegami, T., Won, S., Peters, C. J., Makino, S. Rescue of infectious rift valley fever virus entirely from cDNA, analysis of virus lacking the NSs gene, and expression of a foreign gene. J. Virol. 80, 2933-2940 (2006).
  3. Billecocq, A. RNA polymerase I-mediated expression of viral RNA for the rescue of infectious virulent and avirulent Rift Valley fever viruses. Virology. 378, 377-384 (2008).
  4. Habjan, M., Penski, N., Spiegel, M., Weber, F. T7 RNA polymerase-dependent and -independent systems for cDNA-based rescue of Rift Valley fever virus. J. Gen. Virol. 89, 2157-2166 (2008).
  5. Gerrard, S. R., Bird, B. H., Albarino, C. G., Nichol, S. T. The NSm proteins of Rift Valley fever virus are dispensable for maturation, replication and infection. Virology. 359, 459-465 (2007).
  6. Billecocq, A. NSs protein of Rift Valley fever virus blocks interferon production by inhibiting host gene transcription. J. Virol. 78, 9798-9806 (2004).
  7. May, N. L. e. TFIIH transcription factor, a target for the Rift Valley hemorrhagic fever virus. Cell. 116, 541-550 (2004).
  8. Ikegami, T. Rift Valley fever virus NSs protein promotes post-transcriptional downregulation of protein kinase PKR and inhibits eIF2alpha phosphorylation. PLoS Pathog. 5, e1000287-e1000287 (2009).
  9. Habjan, M. NSs protein of Rift valley fever virus induces the specific degradation of the double-stranded RNA-dependent protein kinase. J. Virol. 83, 4365-4375 (2009).
  10. Garcia-Sastre, A., Biron, C. A. Type 1 interferons and the virus-host relationship: a lesson in detente. Science. 312, 879-882 (2006).
  11. Bon, A. L. e. Type i interferons potently enhance humoral immunity and can promote isotype switching by stimulating dendritic cells in vivo. Immunity. 14, 461-470 (2001).
  12. Le Bon, A., Tough, D. F. Links between innate and adaptive immunity via type I interferon. Curr. Opin. Immunol. 14, 432-436 (2002).
  13. Tough, D. F. Type I interferon as a link between innate and adaptive immunity through dendritic cell stimulation. Leuk. Lymphoma. 45, 257-264 (2004).
  14. Ito, N. Improved recovery of rabies virus from cloned cDNA using a vaccinia virus-free reverse genetics system. Microbiol. Immunol. 47, 613-617 (2003).
  15. Terasaki, K., Murakami, S., Lokugamage, K. G., Makino, S. Mechanism of tripartite RNA genome packaging in Rift Valley fever virus. Proc. Natl. Acad. Sci. U.S.A. 108, 804-809 (2010).
  16. Buchholz, U. J., Finke, S., Conzelmann, K. K. Generation of bovine respiratory syncytial virus (BRSV) from cDNA: BRSV NS2 is not essential for virus replication in tissue culture, and the human RSV leader region acts as a functional BRSV genome promoter. J. Virol. 73, 251-259 (1999).
  17. Diaz, M. O. Homozygous deletion of the alpha- and beta 1-interferon genes in human leukemia and derived cell lines. Proc. Natl. Acad. Sci. U.S.A. 85, 5259-5263 (1988).
  18. Mosca, J. D., Pitha, P. M. Transcriptional and posttranscriptional regulation of exogenous human beta interferon gene in simian cells defective in interferon synthesis. Mol. Cell. Biol. 6, 2279-2283 (1986).
  19. Constantinescu, S. N. Expression and signaling specificity of the IFNAR chain of the type I interferon receptor complex. Proc. Natl. Acad. Sci. U.S.A. 92, 10487-10491 (1995).
  20. Kumar, K. G., Tang, W., Ravindranath, A. K., Clark, W. A., Croze, E., Fuchs, S. Y. SCF(HOS) ubiquitin ligase mediates the ligand-induced down-regulation of the interferon-alpha receptor. EMBO J. 22, 5480-5490 (2003).
  21. Kakach, L. T., Suzich, J. A., Collett, M. S. Rift Valley fever virus M segment: phlebovirus expression strategy and protein glycosylation. Virology. 170, 505-510 (1989).
  22. Kakach, L. T., Wasmoen, T. L., Collett, M. S. Rift Valley fever virus M segment: use of recombinant vaccinia viruses to study Phlebovirus gene expression. J. Virol. 62, 826-833 (1988).
  23. Niwa, H., Yamamura, K., Miyazaki, J. Efficient selection for high-expression transfectants with a novel eukaryotic vector. Gene. 108, 193-199 (1991).
  24. Muller, R. Characterization of clone 13, a naturally attenuated avirulent isolate of Rift Valley fever virus, which is altered in the small segment. Am. J. Trop. Med. Hyg. 53, 405-411 (1995).
  25. Le May, N. A SAP30 complex inhibits IFN-beta expression in Rift Valley fever virus infected cells. PLoS Pathog. 4, e13-e13 (2008).
  26. Kalveram, B., Lihoradova, O., Ikegami, T. NSs Protein of Rift Valley Fever Virus Promotes Post-Translational Downregulation of the TFIIH Subunit p62. J. Virol. 85, 6234-6243 (2011).
  27. Taniguchi, T., Ogasawara, K., Takaoka, A., Tanaka, N. IRF family of transcription factors as regulators of host defense. Annu. Rev. Immunol. 19, 623-655 (2001).
  28. Marie, I., Durbin, J. E., Levy, D. E. Differential viral induction of distinct interferon-alpha genes by positive feedback through interferon regulatory factor-7. EMBO J. 17, 6660-6669 (1998).
  29. Ikegami, T., Won, S., Peters, C. J., Makino, S. Rift Valley fever virus NSs mRNA is transcribed from an incoming anti-viral-sense S RNA segment. J. Virol. 79, 12106-12111 (2005).
  30. Mims, C. A. Rift Valley Fever virus in mice. I. General features of the infection. Br. J. Exp. Pathol. 37, 99-109 (1956).
  31. Bouloy, M. Genetic evidence for an interferon-antagonistic function of rift valley fever virus nonstructural protein NSs. J. Virol. 75, 1371-1377 (2001).
  32. Bird, B. H., Albarino, C. G., Nichol, S. T. Rift Valley fever virus lacking NSm proteins retains high virulence in vivo and may provide a model of human delayed onset neurologic disease. Virology. 362, 10-15 (2007).

Play Video

Cite This Article
Kalveram, B., Lihoradova, O., Indran, S. V., Ikegami, T. Using Reverse Genetics to Manipulate the NSs Gene of the Rift Valley Fever Virus MP-12 Strain to Improve Vaccine Safety and Efficacy. J. Vis. Exp. (57), e3400, doi:10.3791/3400 (2011).

View Video