Construção de um baixo orçamento Laser Sistema axotomia para estudar a regeneração do axônio em C. elegans</em

1. Construção de um sistema de ablação a laser Use óculos de segurança laser e use boas práticas de segurança do laser durante o alinhamento inicial. Nunca olhe através do oculares quando o laser está ligada. Disponha os componentes na breadboard como mostrado na figura. 1 (ver também o exemplo 2). Parafuso para baixo a laser (com uma placa de riser, se necessário), pós periscópio, e os suportes trilho elevado. Posição de seu microscópio para se alinhar com o eixo ferroviário. Alinhar com o feixe de luz transmitido a partir da lente condensador do microscópio. Alinhe a altura do trilho (use um nível) e na posição com uma abertura ajustável ou uma lente de aposta no transporte ferroviário. A abertura ou as lentes devem ser alinhados em ambas as extremidades do trilho para o feixe de condensador. Tomadas de laboratório pode ajudar com o ajuste de altura ferroviário. Alinhar o polarizador Glan-Thompson e meia onda chapa para o feixe de laser. Você não precisa o laser para fazer este alinhamento. O beam apenas precisa passar por tanto sem bater suas bordas. Gire o polarizador de fornecer uma orientação conveniente e posição para o despejo do feixe (fig.1). Você vai rodar a placa de meia onda para ajustar a potência do laser. Seguro os componentes ao breadboard. Ligue o laser, definir a freqüência de pulso a 100, modo contínuo, e reduzir ao mínimo o poder usando a placa de meia onda. Usar uma nota de Post-It ou papel de lente para visualizar o feixe de laser. Ajustar e corrigir os espelhos cinematicamente montados em seqüência a partir do laser para trazer o feixe até o espelho que é montado na extremidade do trilho elevado. O feixe de laser deve estar alinhado aproximadamente ao centro dos espelhos. Os espelhos devem ser orientadas cerca de 45 graus em relação ao eixo do feixe laser (fig. 1). Grosseiramente ajustar o espelho cinematicamente montado no topo do periscópio e sobre o fim do transporte ferroviário para alinhar o feixe de laser para o centro do feixe de luz transmitidos a partir do microscópio. Tanto o feixe de laser e tele transmitiu feixe de luz do microscópio pode ser simultaneamente visualizadas por inserir papel no caminho do feixe. Certifique-se de quaisquer filtros ND e aberturas no módulo intermediário estão fora ou totalmente aberto. Finamente alinhar o feixe de laser para o centro do feixe de luz transmitida com os ajustes finos no topo do periscópio e espelhos ferroviário. Segure o papel perto do espelho ferroviário e alinhar o feixe de laser para o centro do feixe de luz transmitida com o espelho periscópio topo. Segure o papel perto do porto de microscópio e alinhar o feixe de laser para o centro do feixe de luz transmitida com os ajustes ferroviário espelho (fig.2). Posição de um post-it no caminho do feixe entre a lente condensador alinhados ea torre objetivo aberta. Você deverá ver o feixe de luz transmitido com o feixe de laser menores perto do centro. Use os ajustes finos no espelho ferroviário para o centro do feixe de laser. Corrigir o microscópio no lugar com grampos. Os passos 10,9-1,12 são opcionais, mas é fácil e útil para avaliar o alinhamento e ablação a laser antes de adicionar as lentes feixe de expansão. Desligar o laser e envolver o obturador de segurança mecânica. Gire para fora dicróicas de 50% do caminho do feixe. Mesmo que nenhuma luz direta a laser passará para o oculares, a luz refletida pode ser bastante intensa. Montar o slide de destino para o alinhamento fino e imagem, com o objetivo de petróleo 60X. Concentre-se em arranhões no slide. Coloque no ND4 e ND8 filtro no módulo intermediário. Deslize a imagem do alvo com seu CLSM, disco Spinning, ou sistema de câmera CCD. Gire o dicróicas de 50% para o caminho do laser. Partir deste ponto, você nunca deve olhar através oculares enquanto o laser de ablação está ligado. Ligue o laser de ablação e definir o modo como desencadeada freqüência, a 100, eo número de pulso a 10. Certifique-se o poder ainda está definido para o mínimo com a placa de meia onda e depois abrir o obturador de segurança mecânica. Você pode simultaneously imagem e use o laser de ablação. Enquanto imagens do slide-alvo, disparar o laser de ablação. Verifique se o slide de destino para um local hum ablação 1-10 de diâmetro. Seqüencialmente remover filtros ND até o local da ablação é visto. Ajustar o ponto de ablação para o centro da imagem com o espelho ferroviário. Você vai querer voltar a adicionar um filtro ND para ter espaço para aumentar a potência do laser finamente com a placa de meia onda para dar a <1 spot ablação um. Imagem em 0,2 hm / pixel ou menos e finamente ajustar o local da ablação para o centro da imagem (posição 256256, com 512×512 imagem). Verificar a profundidade de foco e eixo do feixe laser. Foco cima e para baixo 1-2 hum e verifique a posição de ablação e tamanho do ponto de ablação. Se o feixe de laser é axialmente alinhados do ponto de ablação não se moverá. O feixe de laser incondicionado vai distribuir poder sobre hum vários (cerca de 3-5 hum de cima para baixo de foco). 2. Adicionar lentes para expandir o feixe de laser para preencher o objectivo de voltaabertura e ajuste de convergência para controle de foco Este sistema utiliza dupla Galileu feixe de expansores para expandir o feixe de laser para encher a abertura de trás do objetivo (10 mm). Monte a 4 lentes para operadoras e anexá-los ao trilho (L1f1 + L2f2 e L3f1 '+ L4f2'). Ajustar as posições para que todas as lentes estão no mesmo eixo óptico e exatamente ortogonal ao feixe de laser (fig. 2). Ligue o laser e ajustá-lo para o mínimo de energia e de modo contínuo. Cerca de ajustar o alinhamento do feixe através de cada lente usando papel para ver o feixe de laser e transmitida feixe de luz a partir do condensador do microscópio. Desligue e obturador a laser. Remova os grampos de um lado do microscópio e deslize o microscópio para fora do caminho do feixe laser. Ligue o laser e remover do obturador de segurança. O alinhamento fino das lentes e do feixe de laser pode ser realizada através da visualização do feixe de laser expandida em uma parede próxima. O feixe deve se expandir e contrair simetricamente quando o leNSES são movidos. Ajustar os últimos dois espelhos cinematicamente montado para alinhar o feixe (fig.3). O perfil do feixe alinhado e expandido deve ser circular e de brilho uniforme (fig.3). O tamanho e uniformidade do feixe pode ser visto com um post-it na posição estimada da abertura traseira objetivo. O feixe deve ser ajustado para zero de convergência para sistemas infinito óptico. Convergência pode ser estimado observando como as mudanças de tamanho feixe de como você mover um post-it mais longe das lentes. Desligar o laser e envolver o obturador mecânico. Deslize o microscópio de volta para o caminho do feixe de laser usando os grampos fixos para definir o alinhamento correto. Substituir os grampos no lado livre de microscópio, mas não aperte para baixo. Ligue o laser e remover o obturador de segurança. Girar a torre objetivo de uma posição aberta. Colocar um post-it no palco. Você deve ver o feixe de laser expandida e uniforme centrado na luz transmitida beam do condensador (fig.4). Você pode precisar para centralizá-la soltando os grampos microscópio e com cuidado empurrando o microscópio. Envolver o obturador de segurança, e definir o laser para acionar o modo. Gire o objetivo 60X no lugar e imagem da superfície de arranhões no slide-alvo. Remover o obturador de segurança, acionar o laser de ablação e ajustar a potência do laser para o ponto mínimo de ablação. O local da ablação deve ser circular e dentro de hum 10/05 do centro da imagem. Centro o ponto de ablação com ajustes finos de espelho ferroviário cinematicamente montado. Você precisará ajustar o iterativamente montado ferroviário e espelho periscópio superior ao centro o ponto de ablação e manter um perfil de luz uniforme. Avaliar o foco do laser Z movendo o foco sistematicamente cima e para baixo em passos de 1 hum e desencadeando o laser de ablação. O feixe expandido, alinhados, e convergência ajustados devem extirpar ao máximo no foco da imagem e fracamente ou não em todos ab 1 umove ou abaixo de foco (fig. 5). Ajuste o foco Z do feixe expandido movendo lente L3 do telescópio de Galileu (fig.2). 3. Laser axotomia e lapso de tempo a microscopia de regeneração do axônio Microondas Agarose 10% (RPI Molecular Biology Grade EEO 0,1 A20090) em solução salina equilibrada até totalmente derretida. Defina em uma chapa quente para mantê-lo derretido durante o uso para montagem. Uma gota de agarose fundida é colocado numa lâmina de vidro e achatado com outra lâmina de vidro em um bloco de cerca de 200 um de espessura (uma única camada de fita de tempo em lâminas adjacentes é usado como um espaçador). A tampa de marcador "Sharpie" é usado para cortar um bloco de diâmetro uniforme circular de 13mm. Anestésico (1ul Muscimol 20mM) e microesferas (Chris Fang-Yen, comunicação pessoal) (2,65% 1ul Poliestireno 0,1 hm em água) são adicionados ao centro do painel seguido de 3-5 worms orientados para que eles estão mentindo em seus lados esquerdo . A lamela de vidro é aplicada e depois Vaseline é usado para selar a lamela e evitar a evaporação da amostra (fig.6). O laser de ablação está alinhada com mira, como descrito acima, no início de cada sessão. Envolver o obturador de segurança laser. Remover o destino de alinhamento a laser e uma imagem de verme adulto montado com um marcador fluorescente apropriado nos neurônios alvo. Axônios imagem com uma ampliação semelhante (0,2 hm / pixel ou maior ampliação) e posição sob a mira (fig.7). Abrir o obturador de segurança laser e acionar o laser de ablação, enquanto imagem. Avaliar o axônio após desencadear a laser e lentamente aumentar potência do laser até o axônio é cortado. Você vai precisar de cerca de 10X mais potência do laser para cortar os axônios do que para formar um ponto de ablação no slide alvo de alinhamento (cerca de 1uJ / ns pulso). Normalmente, cortado com 100 pulsos em 2,5 kHz e poder definir a cerca de 0.27mW (potência média medida na amostra com o medidor de energia coerente FieldMaxII e laser contínuo definido para a 2500 Hz). A ablaçãolaser de potência serão consistentes para o corte de axônios em experimentos futuros (fig.7). Um axônio com sucesso corte irá mostrar uma pausa de cerca de 0,5-1 hum sem perda de brilho nas duas extremidades cortadas (fig.7). Uma grande perda de brilho ou uma grande diferença (2-10 um), muitas vezes significa grandes danos além do axônio por uma bolha de cavitação. Os axônios proximal e distal irá separar e formar bulbos retração nos próximos 30 minutos (fig. 8 e Filme). Equilibrar o seu worms montado com o seu estágio do microscópio por 30 minutos antes de iniciar a gravação de lapso de tempo. Isso irá minimizar deriva devido a diferenças de temperatura e contração de agarose. ) Parâmetros Time-lapse de imagens são criadas usando o software de imagem associada ao seu sistema. Normalmente, as etapas de imagem 20/10 Z (1um/step) em 0,1-0,2 hum / pixel usando ganho, pinhole, taxa de varredura, e as configurações de imagem potência do laser que minimizem a exposição ao dar a resolução desejada espacial. Intervalos de amostragem são típicosly 1-5 minutos mais de 15 horas, dependendo da resolução desejada temporal (fig. 8 e Filme). Dados de lapso de tempo de imagem são convertidos em filmes com elementos NIS ou ImageJ. 4. Resultados representativos: Laser axotomia usando este sistema é confiável e de rotina. Os resultados mostrados na figura 7 são típicas. Lapso de tempo de imagem de regeneração do axônio é muito robusto usando esse protocolo. Nós rotineiramente cortado e imagem até 5 axônios em 5 worms diferentes em um único slide usando um palco motorizado. A única limitação é o tempo que leva para coletar as imagens de cada axônio, por exemplo, se leva 20 segundos para coletar uma pilha para um axônio, em seguida, no máximo, você pode provar 9 axônios (9 pilhas) se você estiver de amostragem a cada 180 segundos. O exemplo mostrado nas Figuras 8 e 9 é um resultado bom representante. Cerca de 10% dos experimentos dão resultados desta qualidade. Os experimentos restantes fornecem bons dados sobre o fenótipo de regeneração, mas são esteticamente unappealção por causa de pequenos movimentos jittering do worm, que geralmente começam após 5-8 horas de imobilização. Figura 1 sistema de ablação por laser. O Nd nm 532: Yag laser é montado em uma placa de riser para trazê-la à altura dos outros componentes e aparafusado ao breadboard. (Isolador óptico é opcional e, provavelmente, não é necessário). O polarizador Glan-Thompson e meia onda placa são usados ​​para controlar finamente a potência do laser. Eles estão em montagens de rotação finamente calibrada. Tome cuidado para definir o despejo do feixe. O espelho de canto dirige o feixe de laser para o espelho inferior periscópio. O espelho periscópio superior dirige o feixe para o espelho ferroviário. O trilho é montada em duas plataformas da haste apoiada. Dupla lentes de Galileu estão ligados a suportes trilho deslizante. Observe o módulo adicionado intermediária dedicada ao laser de ablação. O sistema poderia ser mais compacto, removendo o isolamento ópticotor eo espelho de canto, e reposicionamento do laser, Glan-Thompson polarizador e placa de meia onda para a borda traseira da breadboard. Figura 2 Dual lentes condicionado Galileu são usados ​​para expandir os 300 hm TEMoo feixe de laser a uma convergência de zero tamanho uniforme de 10 mm. A tomada de laboratório é posicionado sob uma das plataformas de exploração do trilho. Isso ajuda no ajuste da altura do trilho durante as etapas de alinhamento. Cruamente ajustar a altura ferroviário montando a lente L1 ao trilho e usando o feixe de condensador como um guia de alinhamento. Ajustar o trilho de modo que o feixe de condensador alinha ao centro da lente em ambas as extremidades do trilho. Isso irá garantir o trilho está alinhado paralelamente ao eixo óptico do microscópio. Você pode precisar ajustar o primeiro microscópio para coincidir com o eixo óptico do trilho. Use grampos para fixar a posição do microscópio (vide fig. 1). Remover ªe ferroviário montado lente. Agora alinhar o feixe de laser para o centro do feixe de condensador em ambas as extremidades do trilho. Um artigo no caminho do feixe é uma maneira conveniente de ver os dois feixes simultaneamente. Use o espelho periscópio top para alinhar o feixe de laser para o feixe de condensador próximo ao espelho instaladas sobre carris. Use o trilho montado espelho para alinhar o feixe de laser para o feixe de condensador no extremo do trilho (mais próximo ao microscópio). Agora montar todos os quatro lentes para o trilho, como mostrado na figura. O comprimento do trilho, o comprimento focal das lentes, bem como as modalidades de lente irá variar dependendo do seu microscópio e set up físico. Parâmetros críticos são o diâmetro do feixe laser eo tamanho da abertura de trás do objetivo escolhido. Sistemas infinito óptico irá focar um feixe de laser perfeitamente paralelos (zero de convergência). Distância entre L1 e L2 devem ser soma das lentes de distâncias focais, f1 + f2, e distância entre L3 e L4 deve ser correspondentemente f1 '+ f2 ". A distância entre ªpares e dupla Galileu não é crítica. Posição de L3 podem ser finamente ajustados para controlar a convergência do feixe; ajustes <1mm será necessário para ajustar o foco do laser para o foco da imagem. Certifique-se de remover todas as lentes, filtros, aberturas, etc a partir do módulo intermediário que pode estar no caminho do feixe (ou estar cientes do que fazem e ajustar o seu sistema em conformidade). Figura 3 Alinhamento do feixe de laser através das lentes dupla Galileu. Remova os grampos microscópio de um lado do microscópio para o microscópio pode ser movido para fora do caminho do feixe, mas os grampos restantes permitirá que o microscópio para ser precisamente reposicionada. Pense na segurança laser. Certifique-se que a potência do laser é ajustada para um mínimo com o polarizador Glan-Thompson. Ligue o laser e exibir o padrão de feixe de laser na parede. Você pode encontrar um papel colado na parede ajuda a visualizar o laserspot. Sistematicamente ajustar as posições das lentes para começar uma sensação para o que eles fazem com o tamanho do feixe e aparência. Você deve ver algo que se parece com painel A, onde o local é intensa excentricamente localizada em um perfil de dimmer. Use o espelho montado em trilho para ajustar o ponto forte para o centro, como mostrado no painel B. Agora use o periscópio montado na parte superior do espelho para dar um perfil uniforme periféricos. Se tudo estiver alinhado corretamente, você agora deve achar que movimentação das lentes faz com que o feixe de expandir e contrair de forma simétrica. Mover as lentes de volta para as posições de partida, como mostrado na figura 2. Agora interceptar o feixe a uma distância da abertura traseira objetivo. Deve ser circular, pelo menos, grande o suficiente para encher a sua abertura para trás, e de um brilho uniforme. É OK se for maior, contanto que você tem poder suficiente para o seu laser de ablações. Avaliar a convergência, comparando diâmetro do feixe na distância da abertura da volta objetiva e na parede. Diâmetro do feixe deveser idêntico para um feixe de convergência zero. Barra de escala é de 10mm. Figura 4 Alinhamento do feixe de laser expandida para o feixe de condensador. Obturador e mover o laser do microscópio de volta para o caminho do feixe de laser usando as garras como paradas de alinhamento. Ligue, alinhar e focar o feixe do condensador utilizando um papel para lentes. Tape objetivo sobre o oculares para evitar que alguém de ver a luz do laser intensa refletida. Girar a torre objetivo de uma posição aberta. Coloque um pedaço de papel no palco para ocluir o feixe de condensador. Ligar o laser de modo contínuo e remover o obturador de segurança mecânica. Você deverá ver um pouco de luz a laser vindo embora o microscópio. Solte os grampos microscópio e delicadamente nudge o microscópio para alinhar o feixe de laser com o feixe de condensador. O feixe de laser deve ser circular e de brilho uniforme. Às vezes é útil para adjuª o trilho montado lentes. Você deve ser capaz de se expandir e contrair o feixe de laser uniformemente se o alinhamento está correto. Você pode centralizar o feixe de laser contratada para o feixe de condensador mínimo centrada com o espelho montado em trilho e depois expandi-lo para o tamanho desejado. Uma vez que você ajustar a posição do feixe de contrato com o espelho ferroviário, você terá de reajustar o espelho periscópio montado na parte superior para manter um brilho uniforme do feixe expandido. Se você não puder obter um feixe de laser circular centrado, então você terá que voltar com as etapas anteriores de alinhamento. Figura Center 5 a mancha de ablação e ajustar a convergência do feixe de laser para focagem. Desligue e obturador a laser. Retire o papel e montar o slide-alvo espelhado (você também pode usar tinta de marcador permanente em uma lamela como meta 2). Arranhões imagem na superfície espelhada com os 60X lente de óleo 1.4na) Agora a imagem da superfície com uma confocal ou CCD. Não olhe através do oculares enquanto o laser está ligada. Ligue e unshutter a laser. Definir o laser para acionar o modo, menor consumo de energia, e 100 Hz. Acionar cerca de 10 pulsos. Você deverá ver um local de ablação de 1-5 um de diâmetro dentro de 10 um do centro de visão. Se você não vê um local de ablação você pode aumentar a potência do laser em passos de 5-10%. Depois de identificar o local da ablação, centro-la para o campo de visão. Colocar a cruz em 256, 256 coordenadas se a visualização de imagens 512×512. Se você ajustar o ponto do laser para o centro, então não vai mudar de posição com o zoom. Use o espelho montado em trilho para mover o ponto de ablação para a mira centro. Reavaliar a uniformidade do feixe de laser ao olhar para o feixe com o objetivo removido, como descrito acima na Figura 4. Ajustar a uniformidade do feixe com o espelho superior periscópio montado. Repita a avaliação da posição à vista de ablação. Este é um processo iterativo process que deve ser repetido até o local da ablação é centrado eo feixe expandido é uniforme. Se feito corretamente o local da ablação será circular como se vê no local da ablação em Foco na figura. Em seguida avaliar o foco do feixe de laser no eixo Z. Acionar o laser para produzir um ponto de ablação de cerca de 1 um no centro. Agora mova a lâmina de cerca de 5 hum lateralmente e 1 um foco abaixo da superfície da lâmina alvo. Acionar o laser usando as configurações mesmo laser que você usou para o local da ablação em primeiro lugar. Repita depois de focar um hum acima da superfície da lâmina alvo. Se o feixe de laser é focado para o foco da imagem, então você deve ver um padrão semelhante ao mostrado nesta figura. O ponto maior de ablação deve corresponder ao foco da imagem e os pontos de ablação acima e abaixo foco deve ficar menor simetricamente. Ajuste da lente L3 para alinhar planos focais. Movimento da lente L3 longe do microscópio fará o feixe mais convergentes e local da ablação vai aproximar-seo objetivo. Pequenos ajustes <1mm serão necessários perto de foco. Agora você está pronto para cortar axônios. Barra de escala é de 1 um. Figura 6 worms de montagem para a laser axotomia e lapso de tempo de imagem. Agarose 10% em solução salina é aquecida até derreter totalmente. Uma pequena gota é colocada sobre uma lâmina de vidro e então achatado, com outro slide para formar um bloco de apartamento. A espessura da almofada é definido por fita em duas lâminas adjacentes. A almofada é permitido para definir por cerca de 1 minuto e, em seguida, as lâminas são separados. A "Sharpie" top é usado como um cortador de biscoitos para formar um bloco uniforme de tamanho de cerca de 13 milímetros. 1 ul de 10mm Muscimol e 1 ul de microesferas são adicionados ao centro do painel (Fang Yen-comunicação pessoal). Worms são adicionados à queda de 2 ul e orientado antes de colocar a lamela de vidro. Vaselina é aplicada a partir de uma seringa (20-25 ga agulha.) Até à extremidade da lamela para selá-lo. <pclass = "jove_content"> Figura 7 resultados típicos de laser axotomia em C. elegans. Em A você pode ver o axônio intacta pouco antes e depois do laser axotomia. A diferença é normalmente cerca de 0,5-1um. B mostra a laser axotomia de um axônio sem danificar um axônio próximo cerca de 1 hum distância. Laser foi ajustado para cerca de 10% de energia (0,3 MW médios em 2500 Hz), e 100 pulsos. Barra de escala é de 5 um. Figura 8. Tipo selvagem típicos L4 regeneração. Esta é uma série de tempo, mostrando a ablação e lapso de tempo de gravação de regeneração do axônio. Logo após a laser axotomia em 0 minutos, você pode ver o bulbo de retração. Por 138 minutos, o bulbo de retração tem puxado de volta à sua mais distante extensão e agora começou a remodelar. Saliências membrana esporádica (mircospikes ou filopodia) pode ser visto ao longo do eixo do axônio (setas 138 e 324). Ocoto direito se estende um cone bem formado crescimento compacto com 360 minutos. Em 414 minutos ambos os cotos estenderam cones de crescimento. Inicial cones embrionárias-like growth se distróficas como eles estendem em direção ao cordão nervoso dorsal (414, 519 e 597 minutos). O distróficos crescimento stall cones curta do cordão nervoso dorsal (960 minutos). Setas apontam coto proximal e cones de crescimento. Setas apontam saliências membrana ao longo do eixo do axônio proximal. Bar 20um escala. Movie 1. Filme de regeneração do axônio tipo selvagem. Este filme vai junto com os pontos de tempo mostrado na Figura 8. Worms foram montados conforme descrito no protocolo e axônios foram fotografadas a cada três minutos por cerca de 10 horas. Z pilhas (20 X 1um) foram tomadas em cada momento e se fundiram em imagens individuais por um algoritmo de projeção máxima (Elements NIS). Clique aqui para assistir o filme.