Bilaminar Co-cultivo de neuronas de rata primaria cortical y la glía
Summary
Aquí les ofrecemos un protocolo para el cultivo de neuronas de rata cortical en presencia de una capa alimentadora glial. Los cultivos de neuronas de establecer la polaridad y la creación de sinapsis, y se puede separar de la glía para su uso en diversas aplicaciones, tales como la electrofisiología, imágenes de calcio, los ensayos de supervivencia de las células, inmunocitoquímica, y ADN / ARN / aislamiento de las proteínas.
Abstract
Este video le guiará en el proceso de cultivo de neuronas de rata cortical en presencia de una capa alimentadora glial, un sistema conocido como bilaminar o el modelo de co-cultivo. Este sistema es adecuado para una variedad de necesidades experimentales de solicitar un sustrato de vidrio o de plástico y el crecimiento también puede ser utilizado para el cultivo de otros tipos de neuronas.
Las neuronas corticales de rata obtenidos a partir de la última etapa embrionaria (E17) se colocan sobre un cubreobjetos de vidrio o platos de cultivo de tejidos frente a una capa de alimentación de las células de crecer en los platos o laminillas de plástico (conocido como Thermanox), respectivamente. La elección entre las dos configuraciones depende de la técnica específica experimental utilizado, que puede requerir, o no, que las neuronas se producen en el vidrio (por ejemplo, imágenes de calcio en comparación con Western blot). La capa de alimentación gliales, una cultura astroglía enriquecida de las células de secundaria mixta, es preparado por separado a partir de las cortezas de las crías recién nacido (P2-4) con anterioridad a la neuronaldisección.
Una gran ventaja de este sistema de cultivo en comparación con una cultura de neuronas sólo es el soporte del crecimiento neuronal, la supervivencia y la diferenciación proporcionada por factores tróficos secretada por la capa de alimentación gliales, que se asemeja más precisión el entorno del cerebro in vivo. Por otra parte, el co-cultivo pueden ser usados para estudiar las interacciones neuronales-gliales 1.
Al mismo tiempo, la contaminación de las células de la capa neuronal es prevenir por diferentes medios (la cultura de baja densidad, además de inhibidores de la mitosis, la falta de suero y el uso de medio de cultivo optimizado) que conduce a una capa neuronal prácticamente pura, comparable a otros métodos establecidos 1 -3. Las neuronas pueden ser fácilmente separada de la capa gliales en cualquier momento durante el cultivo y se utilizan para diferentes aplicaciones experimentales que van desde la electrofisiología 4, biología celular y molecular 05.08, bioquímica 5, imágenes y micrófonoroscopy 4,6,7,9,10. Las neuronas primarias se extienden axones y dendritas para formar sinapsis funcionales 11, un proceso que no se observa en líneas de células neuronales, aunque algunas líneas celulares se extienden los procesos.
Un protocolo detallado de las neuronas del hipocampo de rata de cultivo que utilizan este sistema de co-cultivo ha sido descrita previamente 4,12,13. Aquí detallamos un protocolo modificado adecuado para las neuronas corticales. Ya que aproximadamente 20×10 6 células se recuperan de cada embrión de rata, este método es especialmente útil para los experimentos que requieren un gran número de neuronas (pero no se preocupa acerca de una población neuronal altamente homogénea). La preparación de las neuronas y la glía es necesario planificar de una manera y plazos específicos. Vamos a ofrecer el protocolo paso a paso para el cultivo de neuronas de rata cortical, así como el cultivo de células gliales de apoyo a las neuronas.
Protocol
Discussion
Este protocolo proporciona un método para el cultivo de neuronas corticales primarias de rata en la presencia de células de la glia, al tiempo que permite que las neuronas se pueden aislar fácilmente para el análisis experimental. El apoyo al desarrollo de las células de un fenotipo neuronal sanos, mientras que las respuestas neuronales también la modulación a los tratamientos experimentales de una forma fisiológicamente relevantes. Además, por pases antes de la glía principal cultivo de neuronas con esta pobl…
Disclosures
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
Los autores agradecen a los miembros anteriores de laboratorio que han contribuido al perfeccionamiento de este protocolo y los NIH para el apoyo en los últimos años (DA19808 y DA15014 a OM). Anna Abt 1 es un miembro de la "Formación de Investigación Interdisciplinaria y traslacional en neuroSIDA" (T32-MH078795), por lo que este trabajo fue apoyado en parte por los Institutos Nacionales de Salud, bajo Ruth L. Kirschstein Premio de Investigación del Servicio Nacional de 5T32MH079785.
Materials
| Reagent | Concentration |
|---|---|
| Glucose | 16 mM |
| Sucrose | 22 mM |
| NaCl | 135 mM |
| KCl | 5 mM |
| Na2HPO4 | 1 mM |
| KH2PO4 | 0.22 mM |
| HEPES | 10 mM |
| pH | 7.4 |
| Osmolarity | 310±10 mOsm |
Table 1. Dissection Medium.
| Reagent | Concentration |
|---|---|
| DMEM | 90% |
| FBS | 10% |
| Gentamicin | 50 μg/mL |
Tabe 2. Glia Plating Medium.
| Reagent | Concentration |
|---|---|
| DMEM | 90% |
| Horse Serum | 10% |
Table 3. Neuron Plating Medium.
| Reagent | Concentration |
|---|---|
| DMEM | 98% |
| N2 Supplement | 1% |
| 1M HEPES | 1% |
| Ovalbumin | 50 mg/100mL |
Table 4. N2 Medium.
| Reagent | Concentration |
|---|---|
| Boric Acid | 50 mM |
| Sodium Borate | 12.5 mM |
Table 5. Borate Buffer (for poly-lysine).
| Reagent | Company | Catalogue number |
|---|---|---|
| High glucose Dulbecco’s Modified Eagle Medium (DMEM) |
Invitrogen | 11995-073 |
| Fetal Bovine Serum (FBS), Heat-inactivated | Hyclone | 26400-044 |
| Horse Serum, Heat-inactivated | Hyclone | H1138 |
| Gentamicin (50mg/mL) | Invitrogen | 15750-060 |
| N2 Supplement (100x) | Invitrogen | 17502-048 |
| HEPES buffer solution | Invitrogen | 15630-080 |
| Albumin from chicken egg white, Grade VI (Ovalbumin) |
Sigma-Aldrich | A2512 |
| 2.5% Trypsin | Invitrogen | 15090-046 |
| 0.5% Trypsin-EDTA (10X) | Invitrogen | 15400-054 |
| Deoxyribonuclease I from bovine pancreas (DNase) |
Sigma-Aldrich | D-5025 |
| Paraplast | Fisher | 12-646-106 |
| Poly-L-lysine | Sigma-Aldrich | P1274 |
| Cytosine-β-D-arabinofuranoside hydrochloride | Sigma-Aldrich | C6645 |
| Stereomicroscope | Leica | Leica ZOOM 2000 |
| Cover glasses, Circles, 15 mm, Thickness 0.13-0.17 mm |
Carolina | 633031 |
| Thermanox sheets | Grace BioLabs | HS4550 |
| Large forceps | Biomedical Research Instruments |
70-4000 |
| Fine-tipped No.5 forceps | Fine Science Tools |
91150-20 |
| Pattern No.1 forceps | Biomedical Research |
10-1400 |
| Instruments | ||
| Scissors, straight, sharp-blunt | Biomedical Research Instruments |
28-1435 |
| Micro Dissecting scissors | Biomedical Research Instruments |
11-2070 |
| Micro Dissecting Curved scissors | Biomedical Research Instruments |
11-1395 |
References
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