初代ラット皮質ニューロンとグリアのBilaminarの共培養
Summary
ここでは、グリアフィーダー層の存在下で培養ラット大脳皮質ニューロンのためのプロトコルを提供しています。培養神経細胞は極性を確立し、シナプスを作成し、そのような電気生理学、カルシウムイメージング、細胞生存アッセイ、免疫細胞化学、およびRNA / DNA /タンパク質の分離など、さまざまな用途での使用のためのグリア細胞から分離することができる。
Abstract
このビデオでは、グリアフィーダー層、bilaminarまたは共培養モデルとして知られているシステムの存在下で培養ラット大脳皮質ニューロンのプロセスをガイドします。このシステムは、ガラスまたはプラスチック製の成長基板のどちらかを必要とする実験の様々なニーズに適しており、ニューロンの他のタイプの培養にも使用できます。
後期胚のステージ（E17）から得られたラット皮質ニューロンは、ガラス製カバースリップまたはそれぞれ、皿やプラスチック製のカバースリップ（Thermanoxとして知られている）上に成長させたグリア細胞のフィーダー層が直面している組織培養皿に播種されています。 2つの構成の選択は、特定の実験が必要な場合があります使用されるテクニック、、かどうかに依存し、そのニューロンは、ガラス（例えば、カルシウムイメージングに対するウエスタンブロット）で栽培されています。グリアフィーダー層、混合グリア細胞のアストログリア富化二次培養は、別々に新生仔ラットの皮質（P2 – 4）から神経細胞への事前の用意されています解剖。
神経細胞の培養物と比較して、この培養系の主な利点は、唯一の神経細胞の成長、生存、そしてより正確に生体内で脳の環境に類似したグリアフィーダー層、から分泌される栄養因子が提供する差別化のサポートです。また、共培養は、ニューロングリアの相互作用1を研究するために使用することができます。
同時に、神経細胞層におけるグリア細胞のコンタミネーションは、他の確立された方法に匹敵する実質的に純粋な神経細胞層につながる別の手段（低密度の文化、有糸分裂阻害剤の添加、最適化された培地の血清および使用の欠如）、1によって阻止される-3。神経細胞は、容易に培養中にいつでもグリア層から分離し、電気生理学4、細胞分子生物学5-8、生化学5、画像処理とマイクに至るまでさまざまな実験的なアプリケーションに使用できますroscopy 4,6,7,9,10。いくつかの細胞株は、プロセスを拡張する作業が主なニューロンは、機能的なシナプス11を形成する神経細胞株で観察されていないプロセスを軸索と樹状突起を拡張。
この共培養系を用いて培養ラット海馬ニューロンの詳細なプロトコールは、以前は4,12,13記載されている。ここでは詳細皮質ニューロンに適した修正プロトコルを。約20×10 6個の細胞がそれぞれのラットの胚から回収されるように、この方法では、ニューロン（しかし非常に均一な神経細胞集団が心配ではない）を大量に必要とする実験のために特に有用である。ニューロンとグリア細胞の調製は時間特異的に計画する必要があります。我々は、ニューロンをサポートするために、培養ラット皮質ニューロンと同様に培養グリア細胞のためのステップバイステップのプロトコルを提供します。
Protocol
Discussion
ニューロンは、実験的な分析のために容易に分離できるようにすることながら、このプロトコルでは、グリア細胞の存在下で培養ラット初代皮質ニューロンための方法を提供する。健康な神経表現型のグリアの開発をサポートする一方、生理学的に適切な方法で実験的な治療にも変調する神経細胞応答。さらに、この細胞集団の神経細胞で培養する前に、主要なグリアを継代することにより?…
Disclosures
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
著者らは、このプロトコルの改良と年間のサポートのためのNIH（DA19808とOMにDA15014）に貢献した以前の研究室のメンバーに感謝。アンナアプト1"neuroAIDSの学際的およびトランスレーショナルリサーチ研修"（T32 – MH078795）の仲間であり、したがって、この作業はルースL.キルシュシュタイン国立リサーチサービス賞5T32MH079785下の国立衛生研究所によって部分的にサポートされていました。
Materials
| Reagent | Concentration |
|---|---|
| Glucose | 16 mM |
| Sucrose | 22 mM |
| NaCl | 135 mM |
| KCl | 5 mM |
| Na2HPO4 | 1 mM |
| KH2PO4 | 0.22 mM |
| HEPES | 10 mM |
| pH | 7.4 |
| Osmolarity | 310±10 mOsm |
Table 1. Dissection Medium.
| Reagent | Concentration |
|---|---|
| DMEM | 90% |
| FBS | 10% |
| Gentamicin | 50 μg/mL |
Tabe 2. Glia Plating Medium.
| Reagent | Concentration |
|---|---|
| DMEM | 90% |
| Horse Serum | 10% |
Table 3. Neuron Plating Medium.
| Reagent | Concentration |
|---|---|
| DMEM | 98% |
| N2 Supplement | 1% |
| 1M HEPES | 1% |
| Ovalbumin | 50 mg/100mL |
Table 4. N2 Medium.
| Reagent | Concentration |
|---|---|
| Boric Acid | 50 mM |
| Sodium Borate | 12.5 mM |
Table 5. Borate Buffer (for poly-lysine).
| Reagent | Company | Catalogue number |
|---|---|---|
| High glucose Dulbecco’s Modified Eagle Medium (DMEM) |
Invitrogen | 11995-073 |
| Fetal Bovine Serum (FBS), Heat-inactivated | Hyclone | 26400-044 |
| Horse Serum, Heat-inactivated | Hyclone | H1138 |
| Gentamicin (50mg/mL) | Invitrogen | 15750-060 |
| N2 Supplement (100x) | Invitrogen | 17502-048 |
| HEPES buffer solution | Invitrogen | 15630-080 |
| Albumin from chicken egg white, Grade VI (Ovalbumin) |
Sigma-Aldrich | A2512 |
| 2.5% Trypsin | Invitrogen | 15090-046 |
| 0.5% Trypsin-EDTA (10X) | Invitrogen | 15400-054 |
| Deoxyribonuclease I from bovine pancreas (DNase) |
Sigma-Aldrich | D-5025 |
| Paraplast | Fisher | 12-646-106 |
| Poly-L-lysine | Sigma-Aldrich | P1274 |
| Cytosine-β-D-arabinofuranoside hydrochloride | Sigma-Aldrich | C6645 |
| Stereomicroscope | Leica | Leica ZOOM 2000 |
| Cover glasses, Circles, 15 mm, Thickness 0.13-0.17 mm |
Carolina | 633031 |
| Thermanox sheets | Grace BioLabs | HS4550 |
| Large forceps | Biomedical Research Instruments |
70-4000 |
| Fine-tipped No.5 forceps | Fine Science Tools |
91150-20 |
| Pattern No.1 forceps | Biomedical Research |
10-1400 |
| Instruments | ||
| Scissors, straight, sharp-blunt | Biomedical Research Instruments |
28-1435 |
| Micro Dissecting scissors | Biomedical Research Instruments |
11-2070 |
| Micro Dissecting Curved scissors | Biomedical Research Instruments |
11-1395 |
References
- Cook, A. Interactions between chemokines: regulation of fractalkine/CX3CL1 homeostasis by SDF/CXCL12 in cortical neurons. J. Biol. Chem. 285, 10563-10563 (2010).
- Nicolai, J., Burbassi, S., Rubin, J., Meucci, O. CXCL12 inhibits expression of the NMDA receptor’s NR2B subunit through a histone deacetylase-dependent pathway contributing to neuronal survival. Cell. Death. Dis. 1, e33-e33 (2010).
- Sengupta, R. Morphine increases brain levels of ferritin heavy chain leading to inhibition of CXCR4-mediated survival signaling in neurons. J. Neurosci. 29, 2534-2544 (2009).
- Meucci, O. Chemokines regulate hippocampal neuronal signaling and gp120 neurotoxicity. Proc. Natl. Acad. Sci. U. S. A. 95, 14500-14500 (1998).
- Khan, M. Z. Regulation of neuronal P53 activity by CXCR 4. Mol. Cell. Neurosci. 30, 58-66 (2005).
- Patel, J. P. Modulation of neuronal CXCR4 by the micro-opioid agonist DAMGO. J. Neurovirol. 12, 492-500 (2006).
- Shimizu, S. Role of the transcription factor E2F1 in CXCR4-mediated neurotoxicity and HIV neuropathology. Neurobiol. Dis. 25, 17-26 (2007).
- Khan, M. Z. The chemokine receptor CXCR4 regulates cell-cycle proteins in neurons. J. Neurovirol. 9, 300-314 (2003).
- Khan, M. Z. The chemokine CXCL12 promotes survival of postmitotic neurons by regulating Rb protein. Cell. Death. Differ. 15, 1663-1672 (2008).
- Khan, M. Z., Vaidya, A., Meucci, O. CXCL12-mediated regulation of ANP32A/Lanp, a component of the inhibitor of histone acetyl transferase (INHAT) complex, in cortical neurons. J. Neuroimmune. Pharmacol. 6, 163-170 (2011).
- Dotti, C. G., Sullivan, C. A., Banker, G. A. The establishment of polarity by hippocampal neurons in culture. J. Neurosci. 8, 1454-1468 (1988).
- Kaech, S., Banker, G. Culturing hippocampal neurons. Nat. Protoc. 1, 2406-2415 (2006).
- Goslin, K., Banker, G., Goslin, K., Banker, G. . Culturing Nerve Cells. , 339-370 (1998).
- D’Ambrosio, J., Fatatis, A. Osteoblasts modulate Ca2+ signaling in bone-metastatic prostate and breast cancer cells. Clin. Exp. Metastasis. 26, 955-964 (2009).
