Cercarial Dönüşüm ve In vitro Yetiştiriciliği Schistosoma mansoni Schistosomules

Güvenlik önlemleri: Şiştozom cercariae bir kesik veya gözeneklerin ihtiyaçları olmadan doğrudan cilde nüfuz eder ve kronik hastalık schistosomiasis neden olabilir. S. mansoni bir biyogüvenlik düzeyi 2 organizma, bu nedenle uygun kişisel koruyucu ekipman ve enfektif cercaria ile çalışırken uygun güvenlik önlemleri takip edilmelidir. Schistosomes büyümeye dönüştürmek için gerekli ekipmanların çoğu protokol sonunda tabloda belirtildiği gibi birkaç önemli istisnalar dışında, standart. Tüm cercarial çalışma, izole bir odada yapılmalıdır. Schistosomules steril, onaylı biyogüvenlik kaput kültüre olmalıdır. İki kat nitril ya da lateks eldiven giyilmelidir bir laboratuvar önlüğü, su geçirmez bir çift ayakkabı, bilek ve silah için herhangi bir delik veya yırtık ve su geçirmez kol koruyucuları pantolon gerekir. Kazara dökülme durumunda, derhal şiddetle kişi hakkında ise sürtünme,% 70 etanol veya% 10 çamaşır suyu ile kirlenmiş alanda sprey. Bu parazit devre dışı bırakmak için yeterli olacaktır, ancak tüm olası enfeksiyonlara ve ciddiye alınmalıdır. Schistosomules doğuştan enfektif olmasa da, kurumsal kurallar değişir ve BSL2 önlemler noninfeksiyöz yaşam aşamalarında gerekli olup olmadığını belirlemek için danışılmalıdır. Biohazard onaylı bir kapta yapılır ve deney atık atmak sonra herhangi bir potansiyel bulaşıcı madde ile temas eden tüm yüzeyler dezenfekte edin. NOT: Kapak salyangoz ana bidonları, 1 ila 2 gün önce dökülme ve ışıktan korumak için 1. Salyangoz konak cercariae Hasat Yarım distile su ile oda sıcaklığına gelmesi dolu deterjan, 500ml temiz bir behere doldurun. Farklı tarihlerde miracidia ile enfekte konak salyangoz ile çalışıyorsanız, her enfeksiyon tarih için ayrı bir beher kullanmak (salyangoz gelecek deneyler için tekrar olacak, bu özellikle önemlidir). Beher boyutu da kullanıcı deneyimine bağlı olarak daha küçük olabilir. Gerektiği gibi net bir standart akvaryum balığı ve genel amaçlı forseps kullanarak beher döken ve dikkatli bir şekilde yatırmak isteyen enfekte salyangoz ev sahipliği toplayın. Acil bir dökülme Yeri beher akkor bir ışık kaynağı altında yaklaşık 8 ila 12 inç tepsisi. Işığı altında 1-2 saat bekletin. Parlak ışığa maruz kaldığında Cercariae salyangoz konak çıkın. Cercariae karışımı dikkatlice salyangoz dışarı filtre. Karışımının son derece bulaşıcı olduğundan, ekstra güvenlik önlemleri alın. Unutmayın, cercariae doğrudan insan derisi nüfuz edebilir! Herhangi bir partikül atık madde yerleşmelerine izin verme, yaklaşık 15 dakika ışık kaynağı altında karışımı değiştirin. Cercariae beher altındaki enkaz kaçınarak, bir pipetlemeyin kullanarak temiz bir Erlenmeyer şişesinin içine aktarın. Şişesi 60 dakika, cercariae bir köşeye yerleşmek için izin – 45 için karanlık buz üzerinde yaklaşık 45 derecelik bir açıyla yerleştirin. Süpernatantı 75 -% 90% 10 çamaşır suyu ya da% 70 etanol içeren beher kaldırmak ve mevduat, su damlaları pipetlemeyin cercariae damla içeren girmemesine dikkat çekici bir 50 ml pipetlemeyin kullanın. Swirl Erlenmeyer şişesinde çözüm cercariae tekrar süspansiyon yavaşça cercariae içeren. Steril 50 ml konik tüpler için örnek aktarmak için bir pipetlemeyin kullanın. Karanlıkta 20 dakika boyunca buz üzerinde tekrar tüpleri yerleştirin. Cercariae karanlıkta tüp alt kısmına doğru geçer. 2. Schistosomules için cercariae Manuel dönüşüm Başlamadan önce: RPMI 1640 (RPMI,% 5 fetal sığır serumu, 1X Pen / Strep) tamamlamak ve 37 ° C'ye kadar sıcak olun. (Kullanılan fetal sığır serumu inkübasyon inaktive edildiğini çok önemlidir 56 ° C 1 saat schistosomes tamamlamak için duyarlı olmak gibi). Biohazard kaput, her biri 50 ml konik bir pipet veya vakum cihazı kullanılarak çözüm 5 ila 10 ml kadar süpernatant çıkarın. Döner lok uygun boyutta bir şırınga iğnesi bulamaç, çift uçlu, 22 gauge takın. Yavaş yavaş şırınga içine karışımı çizin. Bir şırınga içinde 50 ml tüpler cercariae toplayın. Damlayan dikkatli olun. Unattached iğne ucu kadar olduğu gibi üzerinde dikkatle şırınga açın. Bulamaç iğne bu tarafında başka bir şırınga takın. Cercariae dönüştürmek için iğne ile toplam 40 kez (20 kez ileri ve geri) Pass karışımı. Karışım, alt şırınga bulunan ve üst şırınga boş olduğunu dikey gibi şırınga yerleştirin. Üst şırınga çıkarın ve% 70 Etanol dezenfekte. Mevduat karışımı temiz bir yüksek duvarlı 100mm x 50mm kabına ya da kristalize çanak içine damla damla. % 70 Etanol iğne ve şırınga dezenfekte edin. 37 ° C RPMI 1640 eksiksiz bir medya gibi ekleyinPetri kabı alt Luria suyu plakası dökme gibi tamamen kaplıdır. Petri kabı merkezinde schistosomules toplamak için hafifçe Swirl. Sıçramasını önlemek. Not: Bu adım için daha yeterli merkezinde schistosomules görselleştirmek için kaput ışığı kapatmak için yararlı olabilir. Hemen steril bir damlalık kullanarak yeni bir 12-kuyu hücre kültür plakasına konsantre schistosomules yatırın. 2.9 ve 2.10 schistosomules artık çanak (yaklaşık 10 kat) merkezi bugünkü kadar tekrarlayın. Sonraki her taze bir kuyu koleksiyonu Depozito. Her iyi yarısına kadar (~ 1.5 mL) prewarmed RPMI tam medya ile doldurun. Schistosomules varlığı ve cercariae yokluğu doğrulamak için bir inverted mikroskop gözünüzde canlandırın. Büyümeye CO 2 inkübatör schistosomules – 37 ° C ve% 5 CO 2. 3. Temsilcisi Sonuçlar: Kültür ortamı haline dönüştürülmüş schistosomules Bekleyen transferi, ters bir parlak alan mikroskobu altında (örneğin ekipman tabloya bakınız) görselleştirme Şekil 1, sadece dönüştürülmüş schistosomules iyi olduğu için benzer bir görüntü elde edilmelidir. Potansiyel kirleticiler, sağlam cercariae, kopmuş cercarial kuyrukları, veya diğer çöküntüleri içerebilir. Hiçbir inverted mikroskop varsa, standart bir mikroskop ya da hatta bir diseksiyon kapsamı schistosomules görselleştirmek için yeterli olacaktır. Bu işlem her zaman% 100 cercariae dönüştürmek unutmayın. Şekil 1: Dönüştürülmüş Schistosomulum Şekil 2: Cercariae ve Severed Tails