Nós descrevemos um<em> In vitro</em> Método para esquistossômulos cultura do parasita platelminto<em> Schistosoma mansoni</em>, Através da colheita e transformação de cercárias infectantes do caramujo de água doce Biomphalaria glabrata hospedeiro intermediário.
Esquistossomo parasitas são os agentes causadores da esquistossomose, uma doença crônica e debilitante que afeta mais de 200 milhões de pessoas no mundo e ocupa o segundo lugar à malária entre as doenças parasitárias em termos de saúde pública e impacto sócio-econômico (1-4). Esquistossomo parasitas são vermes trematódeos com um ciclo de vida complexo intercâmbio entre uma vida parasitária em hospedeiros mamíferos e moluscos, com intervenção de natação livre etapas. Brevemente, de natação livre cercárias infectar um hospedeiro mamífero penetrando a pele com a ajuda de proteases secretadas, durante o qual o cercárias perdem a cauda, transformando-se em esquistossômulos. Os esquistossômulos agora deve escapar do sistema imune do hospedeiro, desenvolver um intestino para a digestão das células vermelhas do sangue, e migrar embora os pulmões ea circulação portal rota para seu destino final no sistema porta hepática e, eventualmente, as veias mesentéricas (para S. mansoni) onde homens e mulheres par worms e mate, produzindo centenas de ovos por dia. Alguns dos ovos são excretados a partir do corpo em água doce, onde os ovos eclodem em nado livre miracídios (5-10). Os miracídios infectam espécies de caracóis específica e se transformar em mãe e filha esporocistos, que por sua vez, produzem cercárias infectantes, completando o ciclo de vida. Infelizmente, o ciclo de vida do S. mansoni não podem ser cultivadas in vitro, mas cercárias infectantes podem ser transformados em esquistossômulos, e os esquistossômulos podem ser cultivadas durante semanas para a análise do desenvolvimento do S. mansoni in vitro ou análise de microarray. Neste protocolo, nós fornecemos uma descrição visual de transformação cercárias e no cultivo in vitro de esquistossômulos. Nós eliminaram cercárias infecciosas da Biomphalaria glabrata caramujo hospedeiro e manualmente transformá-los em esquistossômulos, destacando suas caudas usando um emulsificante agulha dupla. A in vitro cercarial transformação e técnicas de cultura esquistossômulos descrito evitar o uso de uma série de mamíferos, o que simplifica a visualização de schistosomes e facilita a coleta do parasita para a análise experimental. Vitro na transformação e técnicas de cultivo de schistosomes ter sido feito há anos (11, 12), mas nenhum protocolo visuais têm sido desenvolvidos que estão disponíveis para toda a comunidade.
Vários problemas potenciais poderiam surgir durante o processo de transformação, no entanto, este protocolo é projetado para evitar a maioria destes problemas. Um risco potencial é o entupimento da agulha de emulsificante, que geralmente surge devido aos detritos que sobraram da colheita no passo 1.3. Certifique-se de permitir que todas as partículas para resolver no passo 1.5 e transferir a cercárias cuidadosamente no passo 1.6 para evitar este problema. Além disso, como descrito anteriormente, trabalhando dentro de um armário de segurança biológica, a utilização de equipamento de proteção individual (escudos, mesmo face) e evitar a pressão excessiva sobre as seringas é aconselhável.
Moradia caudas cercarial pode ser visualizado na mídia, o que é indicativo da separação pobres durante o passo 2.9. As caudas apresentam um movimento espasmo-like e tem uma forma distinta (ver Figura 2), e desta forma são facilmente distinguíveis da esquistossômulos. As caudas podem ser removidos por lavagem a esquistossômulos em excesso de RPMI completo permitindo que os esquistossômulos para resolver. As caudas permanecerá flutuante e pode ser aspirado off.
Se cercárias intactas estão presentes na mídia, a transformação no passo 2.5 não foi executado corretamente. Uma imagem de um cercaria intacta é retratado na Figura 3b, para referência. Se esse problema ocorre, assegurar que a agulha emulsionante a ser utilizado é do tamanho adequado. Além disso, o número de vezes que a mistura cercarial é passado através da agulha pode ser aumentado, apesar de 40 vezes é tipicamente muito mais do que suficiente para chegar perto dos 100% de corte das caudas cercárias.
Transformação da cercária em esquistossômulos foi descrita pela primeira vez em 1974 por Colley e Wikel (13). Desde então, a preparação de esquistossômulos foi feito usando a estratégia do corte com uma agulha e seringa, conforme descrito neste protocolo, ou através de uma abordagem vórtex e separados por gradientes de Percoll (14, 15) ou rodando como demonstrado neste trabalho. Estas duas técnicas para preparar esquistossômulos são belamente descrito por Fred Lewis (16) e mais informações para cultura adicional de esquistossômulos de crescimento a longo prazo pode ser encontrado no NIAID esquistossomo Resource Center ( www.schisto-resource.org ).
The authors have nothing to disclose.
Este projeto foi financiado pela Case Western Reserve University fundos de inicialização fornecido para E. Jolly. Caramujos infectados foram fornecidos pelo Centro de Recursos esquistossomo, NIH-NIAID (Contrato n º HHSN272201000009I NIAID). Agradecemos também a Chris King e Ronald Blanton para o apoio na obtenção de caracóis infectados esquistossomo e para discussões úteis.
Name of reagent | Company | Catalogue number |
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22g x 2-7/8″ Emulsifying needle | Fisher Scientific | 14-825-17G |
RPMI 1640 Medium 1X (500ml) | Invitrogen | 11835030 |
Fetal Bovine Serum (FBS) heat inactivated | Invitrogen | 10082139 |
Penicillin/Streptomycin (100X) | Invitrogen | 15070063 |
Crystallizing Dish (100mm) | Fisher Scientific | 08-741D |
General Purpose Tweezers | Fisher Scientific | 10-316C |
Petco Aquarium net for brine shrimp | Petco | SKU:1190954 |