הרחבת דם היקפיים האדם γδ T תאים באמצעות Zoledronate
Summary
שיטה להרחיב בתאי T γδ מתאי דם היקפיים mononuclear (PBMC) מתואר. PBMC שמקורם בתאי T γδ הם מגורה והרחיב באמצעות zoledronate ו אינטרלויקין -2 (IL-2). הרחבת בקנה מידה גדול של γδ בתאי T יכול להיות מיושם על חיסוני הסלולר עצמיים של סרטן.
Abstract
אדם בתאי T γδ יכול לזהות ולהגיב למגוון רחב של מתח המושרה אנטיגנים, ובכך לפתח מולדת פעילות אנטי סרטניים זיהומיות אנטי רחבה. 1 רוב בתאי T γδ בדם ההיקפי יש קולטן Vγ9Vδ2 T התא. תאים אלה מזהים אנטיגן באופן מרכזי histocompatibility מורכב עצמאית ולפתח פונקציות חזקה מפעיל cytolytic ו-Th1 כמו 1. לכן, γδ ותאי T הם תאים למועמד אטרקטיבי עבור מפעיל חיסוני סרטן. Vγ9Vδ2 שתאי T מגיבים phosphoantigens כגון (E)-4-hydroxy-3-methyl-אבל-2-enyl pyrophosphate (HMBPP), אשר מסונתז חיידקים דרך ביוסינתזה isoprenoid; 2 ו pyrophosphate isopentenyl (IPP), אשר מופק בתאים אוקריוטים דרך מסלול mevalonate. 3 במצב פיזיולוגי, הדור של IPP בתא nontransformed אינו מספיק להפעלת בתאי T γδ. Dysregulation של מסלול mevalonate בתאי גידול מוביל הצטברות של IPP ו γδ הפעלה T לתאים. 3 מאחר aminobisphosphonates (כגון pamidronate או zoledronate) לעכב synthase pyrophosphate farnesyl (FPPS), האנזים הפועל במורד הזרם של IPP במסלול mevalonate, רמות תאיים של IPP ו sensitibity להכרה תאים γδ T ניתן להגדיל על ידי aminobisphosphonates טיפולית. IPP הצטברות הוא פחות יעיל בתאים nontransfomred מאשר תאים סרטניים עם ריכוז רלוונטי פרמקולוגית של aminobisphosphonates, המאפשרים לנו אימונותרפיה של סרטן על ידי הפעלת בתאי T γδ עם aminobisphosphonates. 4 מעניין, IPP מצטבר מונוציטים כאשר PBMC מטופלים aminobisphosphonates, בגלל יעיל ספיגת התרופה על ידי תאים אלו. 5 מונוציטים שמצטברים להיות IPP-הצגת אנטיגן תאים לעורר Vγ9Vδ2 בתאי T בדם ההיקפי. 6 בהתבסס על מנגנונים אלה, אנו פיתח טכניקה להרחבת בקנה מידה גדול של תרבויות γδ T התא באמצעות zoledronate ו interleukin -2 (IL-2). 7 שיטות אחרות להרחבת γδ בתאי T לנצל את pyrophosphate bromohydrin סינתטי phosphoantigens (BrHPP) 8 או 2-methyl-3-butenyl-1-pyrophosphate (2M3B1PP). 9 כל השיטות האלה מאפשרות לשעבר הרחבת vivo, וכתוצאה מכך מספר גדול של תאים T γδ לשימוש חיסוני המאמצת. עם זאת, רק zoledronate הוא מגיב זמינים מסחרית ה-FDA. Zoledronate-מורחבת γδ בתאי T להציג CD27 – CD45RA – פנוטיפ זיכרון מפעיל והתפקוד שלהם ניתן להעריך על ידי IFN-γ assay הייצור 7.
Protocol
Discussion
השיטה המוצגת כאן מאפשרת התפשטות יעילה של תאים T γδ מ PBMC. γδ שתאי T מופעלים והרחיב על ידי zoledronate ו IL-2 לפתח פונקציות מפעיל מלאה, שהתבטאה ייצור ציטוקינים ו cytotoxicity. זה כבר דווח כי pyrophosphate סינתטי phosphoantigens bromohydrin (BrHPP) ו 2-methyl-3-butenyl-1-pyrophosphate (2M3B1PP) להרחיב גם בתאי T γδ, אולם הם אינם זמ?…
Disclosures
The authors have nothing to disclose.
Materials
| Reagent name | Company | Catalogue number | Comments (optional) |
|---|---|---|---|
| ZOMETA | Novartis Pharma K. K | zoledronate | |
| PROLEUKIN | Novartis Pharmaceuticals | human recombinant IL-2 | |
| BD Vacutainer CPT Cell Preparation Tube with Sodium Heparin | BD | 362753 | |
| RPMI1640 | Invitrogen | 21870-076 | |
| ALyS203- medium | Cell Science & Technology Institute | 0301-7 | |
| OpTmizer | Invitrogen | 0080022SA | |
| brefeldin A | Sigma | B5936-200UL | |
| phorbol 12-myristate 13-acetate (PMA) | Sigma | P1585-1MG | |
| ionomycin | Sigma | 13909-1ML | |
| IntraPrep | BECKMAN COULTER | A07803 | |
| anti-human CD3-FITC or PE/Cy5 | BECKMAN COULTER | A07746 FITC A07749 PE/Cy5 |
|
| anti-human CD4-ECD | BECKMAN COULTER | 6604727 | |
| anti-human CD8-PE/Cy5 | BECKMAN COULTER | 6607011 | |
| anti-human CD14-PE/Cy5 | BECKMAN COULTER | A07765 | |
| anti-human CD19-PE | BECKMAN COULTER | A07769 | |
| anti-human CD45-ECD | BECKMAN COULTER | A07784 | |
| anti-human CD56-PE/Cy5 | BECKMAN COULTER | A07789 | |
| anti-human TCRαβ-PE | BECKMAN COULTER | A39499 | |
| anti-human TCR Vγ9-FITC | BECKMAN COULTER | IM1463 | |
| anti-human CD27-PE/Cy5 | BECKMAN COULTER | 6607107 | |
| anti-human CD45RA-ECD | BECKMAN COULTER | IM2711 | |
| anti-human CD69-PE | BD | 555531 | |
| anti-human NKG2D-PE | BECKMAN COULTER | A08934 | |
| Anti-humal IFNγ-PE | BECKMAN COULTER | IM2717U | |
| Mouse IgG1 isotype control-PE | BECKMAN COULTER | A07796 | |
| Mouse IgG1 isotype control-ECD or PE/Cy5 | BECKMAN COULTER | A07797 A07798 |
References
- Bonneville, M., O’Brien, R. L., Born, W. K. γ T cell effector functions: a blend of innate programming and acquired plasticity. Nat Rev Immunol. 10, 467-478 (2010).
- Hintz, M. Identification of (E)-4-hydroxy-3-methyl-but-2-enyl pyrophosphate as a major activator for human γδ T cells in Escherichia coli. FEBS Lett. 509, 317-322 (2001).
- Gober, H. J. Human T cell receptor γδ cells recognize endogenous mevalonate metabolites in tumor cells. J Exp Med. 197, 163-168 (2003).
- Kabelitz, D., Wesch, D., He, W. Perspectives of gammadelta T cells in tumor immunology. Cancer Res. 67, 5-8 (2007).
- Roelofs, A. J. Peripheral blood monocytes are responsible for gammadelta T cell activation induced by zoledronic acid through accumulation of IPP/DMAPP. Br J Haematol. 144, 245-250 (2009).
- Dieli, F. Induction of γδ T-lymphocyte effector functions by bisphosphonate zoledronic acid in cancer patients in vivo. Blood. 102, 2310-2311 (2003).
- Kondo, M. Zoledronate facilitates large-scale ex vivo expansion of functional γδ T cells from cancer patients for use in adoptive immunotherapy. Cytotherapy. 10, 842-856 (2008).
- Espinosa, E. Chemical synthesis and biological activity of bromohydrin pyrophosphate, a potent stimulator of human γδ T cells. J Biol Chem. 276, 18337-18344 (2001).
- Kobayashi, H. Safety profile and anti-tumor effects of adoptive immunotherapy using γδ T cells against advanced renal cell carcinoma: a pilot study. Cancer Immunol Immunother. 56, 469-476 (2007).
- Murali-Krishna, K. Counting antigen-specific CD8 T cells: a reevaluation of bystander activation during viral infection. Immunity. 8, 177-187 (1998).
- Sato, K. Impact of culture medium on the expansion of T cells for immunotherapy. Cytotherapy. 11, 936-946 (2009).
- Abe, Y. Clinical and immunological evaluation of zoledronate-activated Vγ9 γδT-cell-based immunotherapy for patients with multiple myeloma. Exp Hematol. 37, 956-968 (2009).
- Nakajima, J. A phase I study of adoptive immunotherapy for recurrent non-small-cell lung cancer patients with autologous γδ T cells. Eur J Cardiothorac Surg. 37, 1191-1197 (2010).
