Een methode om γδ T-cellen uit het perifere bloed mononucleaire cellen (PBMC) uit te breiden wordt beschreven. PBMC-afgeleide γδ T-cellen worden gestimuleerd en uitgebreid met behulp van zoledronaat en interleukine-2 (IL-2). Grootschalige uitbreiding van γδ T-cellen kunnen worden toegepast op autologe cellulaire immunotherapie van kanker.
Menselijke γδ T-cellen kunnen herkennen en reageren op een breed scala van stress-geïnduceerde antigenen, waardoor het ontwikkelen van aangeboren brede anti-tumor-en anti-infectueuze activiteit. 1 De meerderheid van de γδ T-cellen in het perifere bloed hebben de Vγ9Vδ2 T-cel-receptor. Deze cellen herkennen antigeen in een grote histocompatibiliteitscomplex-onafhankelijke wijze en ontwikkelen van sterke cytolytische en Th1-like effector functies. 1 Daarom, γδ T-cellen zijn aantrekkelijke kandidaat effector cellen voor immunotherapie van kanker. Vγ9Vδ2 T-cellen reageren op phosphoantigens zoals (E)-4-hydroxy-3-methyl-but-2-enyl pyrofosfaat (HMBPP), dat wordt gesynthetiseerd in bacteriën via isoprenoide biosynthese, 2 en isopentenyl pyrofosfaat (IPP), dat wordt geproduceerd in eukaryote cellen door middel van de mevalonate pad. 3 In fysiologische toestand, de generatie van het IPP in nontransformed cel is niet voldoende voor de activatie van γδ T-cellen. Ontregeling van mevalonaat route in tumorcellen leidt tot een ophoping van IPP en γδ T-cellen te activeren. 3 Omdat aminobifosfonaat (zoals pamidronaat of zoledronaat) remmen farnesyl pyrofosfaat synthase (FPP), het enzym optreedt stroomafwaarts van IPP in de mevalonate route, intracellulaire niveaus van IPP en sensitibity te γδ T-cellen erkenning kan therapeutisch worden verhoogd door aminobifosfonaat. IPP accumulatie is minder efficiënt in nontransfomred cellen dan tumorcellen met een farmacologisch relevante concentratie van aminobifosfonaat, die ons in staat immunotherapie voor kanker door het activeren van γδ T-cellen met aminobifosfonaat. 4 Interessant, IPP zich ophoopt in monocyten wanneer PBMC worden behandeld met aminobifosfonaat, omwille van een efficiënte drug opname door deze cellen. 5 Monocyten die IPP accumuleren worden antigeen-presenterende cellen en stimuleren Vγ9Vδ2 T-cellen in het perifere bloed. 6 Op basis van deze mechanismen, hebben we een techniek ontwikkeld voor grootschalige uitbreiding van γδ T-celculturen met behulp van zoledronaat en interleukine -2 (IL-2). 7 Andere methoden voor de uitbreiding van γδ T-cellen maken gebruik van de synthetische phosphoantigens bromohydrin pyrofosfaat (BrHPP) 8 of 2-methyl-3-butenyl-1-pyrofosfaat (2M3B1PP). 9 Al deze methoden ex toelaten vivo-expansie, wat resulteert in grote aantallen γδ T-cellen voor gebruik in de adoptieve immunotherapie. Echter alleen zoledronaat is een FDA-goedgekeurde commercieel verkrijgbaar reagens. Zoledronaat-geëxpandeerde γδ T-cellen weer te geven CD27 – CD45RA – effector geheugen fenotype en hun functie kan worden geëvalueerd door IFN-γ productie test 7.
De hier gepresenteerde methode maakt een efficiënte uitbreiding van γδ T-cellen uit PBMC. γδ T-cellen geactiveerd en uitgebreid door zoledronaat en IL-2 te ontwikkelen compleet effector functies, weergegeven door cytokine productie en cytotoxiciteit. Het is gemeld dat de synthetische phosphoantigens bromohydrin pyrofosfaat (BrHPP) en 2-methyl-3-butenyl-1-pyrofosfaat (2M3B1PP) ook uit te breiden γδ T-cellen, maar ze zijn niet commercieel beschikbaar. In tegenstelling, is zoledronaat al een licentie voor klinische …
The authors have nothing to disclose.
Reagent name | Company | Catalogue number | Comments (optional) |
---|---|---|---|
ZOMETA | Novartis Pharma K. K | zoledronate | |
PROLEUKIN | Novartis Pharmaceuticals | human recombinant IL-2 | |
BD Vacutainer CPT Cell Preparation Tube with Sodium Heparin | BD | 362753 | |
RPMI1640 | Invitrogen | 21870-076 | |
ALyS203- medium | Cell Science & Technology Institute | 0301-7 | |
OpTmizer | Invitrogen | 0080022SA | |
brefeldin A | Sigma | B5936-200UL | |
phorbol 12-myristate 13-acetate (PMA) | Sigma | P1585-1MG | |
ionomycin | Sigma | 13909-1ML | |
IntraPrep | BECKMAN COULTER | A07803 | |
anti-human CD3-FITC or PE/Cy5 | BECKMAN COULTER | A07746 FITC A07749 PE/Cy5 |
|
anti-human CD4-ECD | BECKMAN COULTER | 6604727 | |
anti-human CD8-PE/Cy5 | BECKMAN COULTER | 6607011 | |
anti-human CD14-PE/Cy5 | BECKMAN COULTER | A07765 | |
anti-human CD19-PE | BECKMAN COULTER | A07769 | |
anti-human CD45-ECD | BECKMAN COULTER | A07784 | |
anti-human CD56-PE/Cy5 | BECKMAN COULTER | A07789 | |
anti-human TCRαβ-PE | BECKMAN COULTER | A39499 | |
anti-human TCR Vγ9-FITC | BECKMAN COULTER | IM1463 | |
anti-human CD27-PE/Cy5 | BECKMAN COULTER | 6607107 | |
anti-human CD45RA-ECD | BECKMAN COULTER | IM2711 | |
anti-human CD69-PE | BD | 555531 | |
anti-human NKG2D-PE | BECKMAN COULTER | A08934 | |
Anti-humal IFNγ-PE | BECKMAN COULTER | IM2717U | |
Mouse IgG1 isotype control-PE | BECKMAN COULTER | A07796 | |
Mouse IgG1 isotype control-ECD or PE/Cy5 | BECKMAN COULTER | A07797 A07798 |