Summary

Uitbreiding van de humane perifere bloed γδ T-cellen met behulp van zoledronaat

Published: September 09, 2011
doi:

Summary

Een methode om γδ T-cellen uit het perifere bloed mononucleaire cellen (PBMC) uit te breiden wordt beschreven. PBMC-afgeleide γδ T-cellen worden gestimuleerd en uitgebreid met behulp van zoledronaat en interleukine-2 (IL-2). Grootschalige uitbreiding van γδ T-cellen kunnen worden toegepast op autologe cellulaire immunotherapie van kanker.

Abstract

Menselijke γδ T-cellen kunnen herkennen en reageren op een breed scala van stress-geïnduceerde antigenen, waardoor het ontwikkelen van aangeboren brede anti-tumor-en anti-infectueuze activiteit. 1 De meerderheid van de γδ T-cellen in het perifere bloed hebben de Vγ9Vδ2 T-cel-receptor. Deze cellen herkennen antigeen in een grote histocompatibiliteitscomplex-onafhankelijke wijze en ontwikkelen van sterke cytolytische en Th1-like effector functies. 1 Daarom, γδ T-cellen zijn aantrekkelijke kandidaat effector cellen voor immunotherapie van kanker. Vγ9Vδ2 T-cellen reageren op phosphoantigens zoals (E)-4-hydroxy-3-methyl-but-2-enyl pyrofosfaat (HMBPP), dat wordt gesynthetiseerd in bacteriën via isoprenoide biosynthese, 2 en isopentenyl pyrofosfaat (IPP), dat wordt geproduceerd in eukaryote cellen door middel van de mevalonate pad. 3 In fysiologische toestand, de generatie van het IPP in nontransformed cel is niet voldoende voor de activatie van γδ T-cellen. Ontregeling van mevalonaat route in tumorcellen leidt tot een ophoping van IPP en γδ T-cellen te activeren. 3 Omdat aminobifosfonaat (zoals pamidronaat of zoledronaat) remmen farnesyl pyrofosfaat synthase (FPP), het enzym optreedt stroomafwaarts van IPP in de mevalonate route, intracellulaire niveaus van IPP en sensitibity te γδ T-cellen erkenning kan therapeutisch worden verhoogd door aminobifosfonaat. IPP accumulatie is minder efficiënt in nontransfomred cellen dan tumorcellen met een farmacologisch relevante concentratie van aminobifosfonaat, die ons in staat immunotherapie voor kanker door het activeren van γδ T-cellen met aminobifosfonaat. 4 Interessant, IPP zich ophoopt in monocyten wanneer PBMC worden behandeld met aminobifosfonaat, omwille van een efficiënte drug opname door deze cellen. 5 Monocyten die IPP accumuleren worden antigeen-presenterende cellen en stimuleren Vγ9Vδ2 T-cellen in het perifere bloed. 6 Op basis van deze mechanismen, hebben we een techniek ontwikkeld voor grootschalige uitbreiding van γδ T-celculturen met behulp van zoledronaat en interleukine -2 (IL-2). 7 Andere methoden voor de uitbreiding van γδ T-cellen maken gebruik van de synthetische phosphoantigens bromohydrin pyrofosfaat (BrHPP) 8 of 2-methyl-3-butenyl-1-pyrofosfaat (2M3B1PP). 9 Al deze methoden ex toelaten vivo-expansie, wat resulteert in grote aantallen γδ T-cellen voor gebruik in de adoptieve immunotherapie. Echter alleen zoledronaat is een FDA-goedgekeurde commercieel verkrijgbaar reagens. Zoledronaat-geëxpandeerde γδ T-cellen weer te geven CD27 CD45RA effector geheugen fenotype en hun functie kan worden geëvalueerd door IFN-γ productie test 7.

Protocol

1. Isolatie van PBMC Draw bloed (7.5-8.0 ml) in een BD Vacutainer CPT celpreparaat Tube met Sodium Heparine. De buis bevat een natrium-heparine en een Ficoll-Hypaque dichtheid vloeistof, plus een polyester gel barrière die de twee vloeistoffen scheidt. Centrifugebuis / bloed bij kamertemperatuur (18 ° C tot 25 ° C) in een horizontale rotor (swing-out head) gedurende 20 min bij 1800 x g. Schakel centrifuge remmen uit. Na het centrifugeren, de volgorde van lagen gebeurt als volgt (van bove…

Discussion

De hier gepresenteerde methode maakt een efficiënte uitbreiding van γδ T-cellen uit PBMC. γδ T-cellen geactiveerd en uitgebreid door zoledronaat en IL-2 te ontwikkelen compleet effector functies, weergegeven door cytokine productie en cytotoxiciteit. Het is gemeld dat de synthetische phosphoantigens bromohydrin pyrofosfaat (BrHPP) en 2-methyl-3-butenyl-1-pyrofosfaat (2M3B1PP) ook uit te breiden γδ T-cellen, maar ze zijn niet commercieel beschikbaar. In tegenstelling, is zoledronaat al een licentie voor klinische …

Disclosures

The authors have nothing to disclose.

Materials

Reagent name Company Catalogue number Comments (optional)
ZOMETA Novartis Pharma K. K   zoledronate
PROLEUKIN Novartis Pharmaceuticals   human recombinant IL-2
BD Vacutainer CPT Cell Preparation Tube with Sodium Heparin BD 362753  
RPMI1640 Invitrogen 21870-076  
ALyS203- medium Cell Science & Technology Institute 0301-7  
OpTmizer Invitrogen 0080022SA  
brefeldin A Sigma B5936-200UL  
phorbol 12-myristate 13-acetate (PMA) Sigma P1585-1MG  
ionomycin Sigma 13909-1ML  
IntraPrep BECKMAN COULTER A07803  
anti-human CD3-FITC or PE/Cy5 BECKMAN COULTER A07746 FITC
A07749 PE/Cy5
 
anti-human CD4-ECD BECKMAN COULTER 6604727  
anti-human CD8-PE/Cy5 BECKMAN COULTER 6607011  
anti-human CD14-PE/Cy5 BECKMAN COULTER A07765  
anti-human CD19-PE BECKMAN COULTER A07769  
anti-human CD45-ECD BECKMAN COULTER A07784  
anti-human CD56-PE/Cy5 BECKMAN COULTER A07789  
anti-human TCRαβ-PE BECKMAN COULTER A39499  
anti-human TCR Vγ9-FITC BECKMAN COULTER IM1463  
anti-human CD27-PE/Cy5 BECKMAN COULTER 6607107  
anti-human CD45RA-ECD BECKMAN COULTER IM2711  
anti-human CD69-PE BD 555531  
anti-human NKG2D-PE BECKMAN COULTER A08934  
Anti-humal IFNγ-PE BECKMAN COULTER IM2717U  
Mouse IgG1 isotype control-PE BECKMAN COULTER A07796  
Mouse IgG1 isotype control-ECD or PE/Cy5 BECKMAN COULTER A07797 A07798  

References

  1. Bonneville, M., O’Brien, R. L., Born, W. K. γ T cell effector functions: a blend of innate programming and acquired plasticity. Nat Rev Immunol. 10, 467-478 (2010).
  2. Hintz, M. Identification of (E)-4-hydroxy-3-methyl-but-2-enyl pyrophosphate as a major activator for human γδ T cells in Escherichia coli. FEBS Lett. 509, 317-322 (2001).
  3. Gober, H. J. Human T cell receptor γδ cells recognize endogenous mevalonate metabolites in tumor cells. J Exp Med. 197, 163-168 (2003).
  4. Kabelitz, D., Wesch, D., He, W. Perspectives of gammadelta T cells in tumor immunology. Cancer Res. 67, 5-8 (2007).
  5. Roelofs, A. J. Peripheral blood monocytes are responsible for gammadelta T cell activation induced by zoledronic acid through accumulation of IPP/DMAPP. Br J Haematol. 144, 245-250 (2009).
  6. Dieli, F. Induction of γδ T-lymphocyte effector functions by bisphosphonate zoledronic acid in cancer patients in vivo. Blood. 102, 2310-2311 (2003).
  7. Kondo, M. Zoledronate facilitates large-scale ex vivo expansion of functional γδ T cells from cancer patients for use in adoptive immunotherapy. Cytotherapy. 10, 842-856 (2008).
  8. Espinosa, E. Chemical synthesis and biological activity of bromohydrin pyrophosphate, a potent stimulator of human γδ T cells. J Biol Chem. 276, 18337-18344 (2001).
  9. Kobayashi, H. Safety profile and anti-tumor effects of adoptive immunotherapy using γδ T cells against advanced renal cell carcinoma: a pilot study. Cancer Immunol Immunother. 56, 469-476 (2007).
  10. Murali-Krishna, K. Counting antigen-specific CD8 T cells: a reevaluation of bystander activation during viral infection. Immunity. 8, 177-187 (1998).
  11. Sato, K. Impact of culture medium on the expansion of T cells for immunotherapy. Cytotherapy. 11, 936-946 (2009).
  12. Abe, Y. Clinical and immunological evaluation of zoledronate-activated Vγ9 γδT-cell-based immunotherapy for patients with multiple myeloma. Exp Hematol. 37, 956-968 (2009).
  13. Nakajima, J. A phase I study of adoptive immunotherapy for recurrent non-small-cell lung cancer patients with autologous γδ T cells. Eur J Cardiothorac Surg. 37, 1191-1197 (2010).

Play Video

Cite This Article
Kondo, M., Izumi, T., Fujieda, N., Kondo, A., Morishita, T., Matsushita, H., Kakimi, K. Expansion of Human Peripheral Blood γδ T Cells using Zoledronate. J. Vis. Exp. (55), e3182, doi:10.3791/3182 (2011).

View Video