Selezione di Plasmodium falciparum Parassiti per Cytoadhesion alle cellule cerebrali umane endoteliali

Raccomandazioni generali Umano microvascolari cerebrali delle cellule endoteliali (HBEC-5i) la cultura è stato precedentemente descritto in 6, 8. P. parassiti falciparum sono stati coltivati ​​come in 9. Entrambi HBEC-5i e P. falciparum culture parassita deve essere conservato in condizioni sterili in ogni momento. Tutti i reagenti devono essere pre-riscaldato a 37 ° C. Si consiglia di controllare regolarmente la contaminazione da micoplasma 10 mediante PCR (Minevera Biolabs, le istruzioni del produttore successivo). Il protocollo è riassunto nella Figura 1. 1. Cellule endoteliali cultura di routine Preparare i reagenti necessari. Medio per preparare Reagenti Quantità "Incompleto DMEM" DMEM-F12 Ham 500ml &nbsp; L-glutammina 200mm 5ml Penicillina / streptomicina 100X 5 ml NaOH 1M 1,3 ml (aggiustare il pH a 7,4) "Completo DMEM" "Incompleto DMEM" 450ml Siero fetale bovino inattivato al calore 50ml Supplemento di crescita delle cellule endoteliali 5 ml Cultura HBEC-5i in una reflex 25 centimetri 2 pallone con media 10ml DMEM completo in un incubatore a 37 ° C con 5% di CO 2. Celle di passaggio quando diventano confluenti. Rimuovere il supporto di vecchia aspirazione e lavare due volte con medium DMEM incompleti o tessuto della cultura di grado PBS (Ca 2 + e Mg 2 + libero) pre-riscaldato a 37 ° C. Aggiungere 1 ml di pre-riscaldato Provapsin-EDTA (0,025% tripsina, 0.5MM EDTA), agitare per coprire la totalità del pallone e incubare per circa 2 min a 37 ° C. Controllare al microscopio invertito che almeno il 90% delle cellule sono stati staccati. In caso di necessità, bussare delicatamente la parte inferiore del pallone per staccare le cellule aderenti. Aggiungere 10 ml di medium DMEM completo di bloccare le cellule tripsina e trasferire in una provetta da 15 ml conica. Centrifugare per 4 min a 300 gr a temperatura ambiente (RT). Eliminare il surnatante e risospendere il pellet con 10 ml di medium DMEM completo. Pipettare la soluzione su e giù per risospendere completamente le cellule. Aggiungere 1 o 2 ml di sospensione cellulare in un pallone nuova cultura e aggiungere 8 ml di terreno fresco per mantenere la cultura. Valutare la crescita della cultura ogni giorno sotto un microscopio rovesciato e il cambiamento di media ogni 2 o 3 giorni prima che diventa gialla. 2. Preparazione cellule endoteliali per una selezione Due giorni prima del giorno del Selectio n, aggiungere fibronectina diluito in PBS sterile (2 mg / cm 2) in uno (o più) 60 millimetri piatto di Petri. Incubare il piatto per 5 a 20 min a 37 ° C, quindi rimuovere la soluzione di fibronectina, che possono essere conservati a 4 ° C per un mese e riutilizzati una volta. Celle di passaggio, come descritto nei paragrafi 1.3. a 1,5. Assumendo che le cellule del 100% confluenti sono state staccate e risospesi in media 10ml DMEM completo (sezione 1.6., Risospendere con un volume equivalente di media se la confluenza è inferiore, ad esempio, risospendere con 8ml se la confluenza è stata 80%), aggiungere 1,5 ml di sospensione cellule alla fibronectina piatto rivestito di Petri e un altro 1,5 ml di medium DMEM completo. Porre la capsula Petri seminati in incubatrice. Nota: Idealmente, la confluenza sarà di circa il 90% al momento della selezione di due giorni dopo. Opzionale. Per attivare HBEC-5i, aggiungere la (fattore di necrosi tumorale) citochina TNF ad una concentrazione finale di 50μg/ml 24 ore precedenti la selezione. e_title "> 3. Plasmodium falciparum routine cultura Preparare i reagenti necessari (vedi tabella qui sotto). Preparare umano globuli rossi (RBC) separando sangue intero (gruppo O +) dal passaggio attraverso un filtro a esaurimento dei leucociti (vedere "Metodi di Ricerca in Malaria" pubblicazione 11 per la coltura generale parassiti della malaria). Lavare RBC due volte per centrifugazione a 400 g per 5 min e risospendere con 10 ml RPMI incompleta. Tenere RBC lavati a 4 ° C in media incompleta al 50% di ematocrito. Medio per preparare Reagenti Quantità "Incompleto RPMI" RPMI 1640 (con il bicarbonato) 500ml Hepes 1M 12.5ml Glucosio 20% 5ml </td> L-glutammina 200mm 5ml Gentamicina 50mg/ml 250μl NaOH 1M 0,7 ml (aggiustare il pH a 7,2) "RPMI completo" "Incompleto RPMI" 450ml Pool umano (non immune) nel siero 50ml Cultura P. falciparum dei globuli rossi infetti con il mezzo RPMI completo al 2% di ematocrito ed incubare a 37 ° C con il 3% di CO 2, 1% O 2, e 96% N 2. Fai striscio Giemsa 11 al giorno per valutare lo stadio di sviluppo di parassiti (Figura 2). Regolarmente (circa una volta alla settimana), sincronizzare la cultura da un trattamento sorbitolo 12. Il giorno prima il test di selezione, allo scopo di un anello allo stadio cultura parassitemia al 5% o più (idealmente almeno 10%). 4. Selezione di P. falciparum per cytoadhesion alle cellule endoteliali Il giorno del test, la cultura parassita dovrebbe essere in fase vegetativa pigmentate (Figura 2) (idealmente parassitemia 10%), mentre HBEC-5i cultura dovrebbe essere da 50 a 100% confluenza (idealmente 90%). 30μl di ematocrito di cultura parassita è necessaria per HBEC-5i piastra di Petri. Lavare i parassiti due volte per centrifugazione (500 g per 5 min) 1,5 ml di cultura parassita. Gettare il surnatante e risospendere con 10 ml di appena fatto, riscaldato, medio DMEM incompleta. Ripetere il lavaggio una seconda volta. Risospendere il volume di 30μl di ematocrito, con 1,5 ml di incompleto con 1% di BSA DMEM. Lavare i HBEC-5i piatto rivestito di Petri due volte aspirante medio e aggiungendo 3 ml di DMEM incompleta. Aggiungere la soluzione di parassiti al HBEC-5i piatto e incubare a 37 ° C per 75 min. Risospendere parassiti due volte (dopo 30 e 60 minuti) durante l'incubazionedelicatamente a dondolo il piatto nelle quattro direzioni, così come in senso orario e antiorario. Dopo l'incubazione, lavare il piatto 5 volte aspirando mezzo, utilizzando una pipetta Pasteur di plastica per aggiungere 3 ml di medium caldo DMEM incompleti, rock e leggera. Se molti piatti vengono utilizzati, tenerli su di una superficie calda, come un gran fiasco pieno d'acqua a 37 ° C. Controllare il piatto sotto un microscopio invertito. Se molti dei globuli rossi infetti sono ancora visibili, fare di più lavaggi come descritto sopra. Maneggiare la piastra Petri con molta attenzione per evitare qualsiasi rischio di contaminazione. Rimuovere media dal piatto e aggiungere 3 ml di medium caldo RPMI completo con 40μl di ematocrito di uRBC fresca. Porre la capsula in una camera stagna in incubazione, il gas per 3 minuti e il luogo della camera in un incubatore a 37 ° C durante la notte. Il giorno dopo, raccogliere i parassiti dal lavaggio con media RPMI incompleta, in modo simile a quanto descritto nel paragrafo 4.4. ma più vigorosamente. Keep tutti mezzo utilizzato (contenente risospeso RBC) in un tubo 15ml conica. Controllare al microscopio invertito che tutte le RBC sono state rimosse dal piatto. Pellet i parassiti, scartare il surnatante, risospendere in 5ml media RPMI completo e inserire il composto in un recipiente per la coltura normale. 5. Rappresentante Risultati Parassiti non selezionati mostrano un basso livello di legame HBEC-5i (Figura 3A). Così, dopo il primo turno di selezione, parassiti molto pochi saranno raccolti e può richiedere fino a un mese di coltura per raggiungere una parassitemia sufficiente per il secondo round di selezione. Dopo ogni turno di selezione, parassiti sempre più si legano alle cellule endoteliali e le selezioni possono essere ripetuti ad intervalli di tempo più brevi. Dopo 4-5 giri di selezione, ad alta vincolante popolazioni parassita sono ottenuti (Figura 3). Nelle nostre mani, il legame di HB3-HBEC a HBEC-5i o TNF attivato HBEC-5i era di simmili livello (dati non riportati). Il protocollo qui descritto è stato testato con 4 P. ceppi di P. falciparum: HB3, IT/FCR3, 3D7 e DD2 (Tabella 1). Solo quest'ultimo non si è dimostrato in grado di legarsi a HBEC-5i, anche dopo 5 turni di selezione. HB3 parassiti sono stati anche selezionati per cytoadherence di cellule microvascolari cutanea e polmonare endoteliale (HDMEC e HPMEC). Dopo 4 turni di selezione, secondo il metodo descritto qui, un alto legame popolazione sono stati ottenuti su entrambi i HDMEC e HPMEC (Figura 4). Figura 1. Panoramica del processo di selezione. Figura 2. Stadi di sviluppo di P. falciparum globuli rossi infetti. Striscio Giemsa visualizzati al microscopio con ingrandimento 1000X. Figura 3. Tipico esempio di parassiti legame HBEC-5i. (A) Lo strato blu è HBEC-5i fissati con glutaraldeide e colorati con Giemsa, visualizzati al microscopio con ingrandimento 1000X. Le foto sono state scattate dopo uRBC e iRBC non legato sono state spazzate via. Il pannello a sinistra mostra un unico P. falciparum HB3 (non selezionato) parassita legato a HBEC-5i. Nel pannello di destra la HB3-HBEC parassiti erano stati selezionati per 5 round. (B) I dati rappresentano la media di due esperimenti indipendenti, ciascuno eseguito in duplice copia. Il numero di parassiti legati per cellule endoteliali è stato contato. Tabella 1. Sintesi dei ceppi di Plasmodium falciparum, che si sono selezionati per il legame a HBEC-5i. HB3 Si noti che è stato anche selezionato per il TNF-attivato HBCE-5i. Dopo 5 turni di selezione, il ceppo DD2 non ha mostrato alcun aumento del legame con HBEC-5i rispetto ai non selezionati-DD2. Figura 4. Legame di P. falciparum HB3 parassiti cutanea (HDMEC) e polmonare (HPMEC), le cellule endoteliali, prima e dopo 4 turni di selezione. Anche se il terreno di coltura per HDMEC e HPMEC differisce leggermente (vedi istruzioni del fornitore), il protocollo utilizzato per la selezione era identico come HBEC-5i. Foto scattate con ingrandimento 400X. Nome del reagente Azienda Numero di catalogo Commenti DMEM-F12 Ham Sigma D6421 Per le medie DMEM completo L-glutammina 200mm GIBCO 25030 Per le medie e DMEM RPMI completo Penicillina / streptomicina 100X (10000 unità / ml e 10 mg) ScienCell 0503 Per le medie DMEM completo Siero fetale bovino inattivato al calore ScienCell 0025 Per le medie DMEM completo Tripsina-EDTA (0,025% tripsina, 0.5mm EDTA) ScienCell 0103 Supplemento di crescita delle cellule endoteliali ScienCell 1052 Per le medie DMEM completo Cultura tessuto trattato 60 mm x 15 millimetri Petri BD 353002 Fibronectina umana Millipore FC010 Utilizzare a 2 mg / cm 2 TNF R &D Systems 210-TA opzionale, l'uso a 50 mcg / ml RPMI 1640 Lonza BE12-167F Per le medie RPMI completo Gentamicina 50mg/ml Lonza 17-518Z Per le medie RPMI completo Hepes 1M Lonza Be17-737E Per le medie RPMI completo HDMEC ScienCell 2000 Linea di cellule primarie HPMEC ScienCell 3000 Linea di cellule primarie HBEC-5i Ottenuto da Francisco Candal (fcandal@cdc.gov) Tabella 2. Materiali