اختيار المتصورة المنجلية الطفيليات لCytoadhesion لخلايا المخ البشري غشائي
Summary
و<em> في المختبر</emيوصف> نموذج للاحتباس الملاريا الدماغية<sup> 1</sup>.<em> المتصورة المنجلية</emويتم اختيار> إصابة خلايا الدم الحمراء للربط إلى خلد الإنسان خلايا الاوعية الدموية الدقيقة في الدماغ البطانية. وطفيليات مختارة تظهر النمط الظاهري متميزة. ويمكن تطبيق عملية الاختيار باستخدام مختلف<em> P. المنجلية</em> سلالات وخطوط الخلايا البطانية.
Abstract
وتحدث معظم الوفيات الناجمة عن الملاريا الإنسان عن طريق الدم في مرحلة طفيليات الملاريا المنجلية. يتميز الملاريا الدماغية ، وأكثر مضاعفات تهدد الحياة من المرض ، من خلال تراكم المنجلية المصابة خلايا الدم الحمراء (iRBC) في المرحلة أتروفة الصباغية في الدماغ microvasculature 2-4. هذه العرقلة microvessel (عزل) يؤدي الى نقص الأكسجة ، الحماض والسيتوكينات الالتهابية الضارة (التي استعرضت في 5). كما توجد في معظم أنسجة تنحية الاوعية الدموية الدقيقة في جسم الإنسان 2 ، 3. لا تزال الآلية التي iRBC نعلق على جدران الأوعية الدموية غير مفهومة.
وقد استخدمت في الاوعية الدموية الدقيقة خلد الدماغ البشري غشائي خط الخليوي (HBEC – 5I) باعتبارها نموذجا في المختبر من حاجز الدم في الدماغ 6. ومع ذلك ، المتصورة المنجلية iRBC إرفاق سيئة فقط لHBEC – 5I في المختبر ، على عكس sequestrat كثيفةأيون التي تحدث في حالات الملاريا الدماغية. قمنا بتطوير بالتالي مقايسة بالغسل لتحديد (إثراء) P. مختلف سلالات المنجلية للالتصاق ل- 5I HBEC من أجل الحصول على السكان العالية ملزمة الطفيليات ، وأكثر تمثيلا لما يحدث في الجسم الحي.
يتم غسل عينة من ثقافة الطفيلي (خليط من RBC iRBC وغير مصاب) في المرحلة أتروفة المصطبغة وحضنت على طبقة من 5I – HBEC نمت على طبق بتري. بعد الحضانة ، يتم غسلها برفق الطبق خالية من uRBC iRBC وغير منضم. تضاف uRBC جديدة لiRBC القليلة المرفقة HBEC – 5I وحضنت بين عشية وضحاها. كما الطفيليات المتقسمة مرحلة الاندفاع ، ويتم حصاد merozoites reinvade RBC وهذه الطفيليات مرحلة الحلقة في اليوم التالي. تستزرع الطفيليات حتى يتم الحصول على ما يكفي من المواد (عادة 2-4 أسابيع) ويمكن إجراء جولة جديدة من التحديد. اعتمادا على P. وهناك حاجة إلى سلالة المنجلية ، من 4 إلى 7 جولات من الاختيار من أجل الحصول على مجموعة من السكانحيث ان معظم الطفيليات ربط – 5I HBEC. فقد تدريجيا النمط الظاهري ملزما بعد بضعة أسابيع ، مما يشير إلى التحول في سطح البديل مستضد التعبير الجيني ، وبالتالي مطلوب اختيار منتظمة عن HBEC – 5I للحفاظ على النمط الظاهري.
باختصار ، طورنا تقديم مقايسة اختيار P. الطفيليات المنجلية أكثر "لاصقة الملاريا الدماغية" النمط الظاهري. كنا قادرين على اختيار 3 من أصل 4 P. سلالات المنجلية – 5I على HBEC. هذا الاختبار بنجاح كما استخدمت لتحديد الطفيليات للربط إلى الخلايا البشرية البطانية الجلد والرئتين. الأهم من ذلك ، يمكن استخدام هذا الأسلوب لتحديد السكان الطفيل أنسجة معينة من أجل تحديد المرشح ليغاندس الطفيلي ملزمة لبطانة الدماغ. وعلاوة على ذلك ، يمكن استخدام هذا الاختبار للكشف عن العقاقير المضادة للاحتباس المفترضة 7.
Protocol
Discussion
السمة المميزة لمرض الملاريا الدماغية هو عزل P. المنجلية iRBC داخل الدماغ microvasculature 2 ، 3. ومع ذلك ، في المختبر من الثقافات P. المنجلية فقط cytoadhere سيئة لHBEC – 5I ، نموذجا لبطانة الاوعية الدموية الدقيقة في الدماغ البشري. وضعت هنا لدينا تجربة مباشرة لإثراء السكان للربط إلى HBEC – 5I ، وأكثر "في الجسم الحي ، مثل" النمط الظاهري. ثلاثة من أصل 4 P. وقد تم اختيار السلالات بنجاح المنجلية باستخدام هذا الأسلوب. علاوة على ذلك ، كما تم اختيار HB3 على HDMEC وHPMEC ، مشيرا الى انه يمكن استخدام هذا البروتوكول عن طفيلي ومختلف أنواع الخلايا البطانية.
فرضيات مختلفة قد تفسر عدم الربط مع سلالة DD2. الأكثر احتمالا هو أن هذا الخط هو knobless الطفيلي ، مما يعوق بشدة cytoadherence 13 و 14.
نوصي الطفيليات زراعة غير محددة الى جانب اختيار المواليةسيس لتوفير مراقبة للمقارنة. هذا سوف يسمح ، على سبيل المثال ، مقارنة transcriptome الطفيليات الملزمة وغير الملزمة ، على أمل اكتشاف المرشحين يجند الطفيلي.
TNF هو خلوى وجدت على مستوى عال في مرضى الملاريا الدماغية ، وقد تبين للحث على التعبير عن الكثير من البروتينات السطحية HBEC – 5I (Claessens آخرون ، في إعداد و 8 و 15 و 16). في هذه الحالة ، كان مبلغ مماثل iRBC ملزمة في الحالات العادية – 5I HBEC مقارنة تنشيط HBEC – 5I.
ويمكن أيضا هذا "النموذج تنحية" يمكن استخدامها لدراسة التفاعل بين iRBC الجزيئية والخلايا البطانية ، فضلا عن تأثير العقاقير المضادة للcytoadherence المفترضة. في هذه الحالة ، ننصح الطلاء HBEC – 5I في الآبار الصغيرة ، مثل "الشرائح الغرفة 8 جيدا" دينار بحريني (354628) أو "CultureWell" (سيغما C7735 – 20EA).
Disclosures
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
نشكر Candal فرانسيسكو ، منها نقل التكنولوجيا مكتب وجورجيا اتلانتا لHBEC – 5I الخلايا. وقد تم تمويل هذا العمل من قبل ويلكوم ترست (4 سنوات دراسية لدرجة الدكتوراه لميلان والزمالات العليا في العلوم الطبية الحيوية الأساسية لJAR ، منحة رقم 084226).
References
- Scherf, A. Antigenic variation in malaria: in situ switching, relaxed and mutually exclusive transcription of var genes during intra-erythrocytic development in Plasmodium falciparum. Embo. J. 17, 5418-5426 (1998).
- MacPherson, G. G., Warrell, M. J., White, N. J., Looareesuwan, S., Warrell, D. A. Human cerebral malaria. A quantitative ultrastructural analysis of parasitized erythrocyte sequestration. Am. J. Pathol. 119, 385-401 (1985).
- Seydel, K. B., Milner, D. A., Kamiza, S. B., Molyneux, M. E., Taylor, T. E. The distribution and intensity of parasite sequestration in comatose Malawian children. J. Infect. Dis. 194, 208-208 (2006).
- Taylor, T. E. Differentiating the pathologies of cerebral malaria by postmortem parasite counts. Nat. Med. 10, 143-145 (2004).
- van der Heyde, H. C., Nolan, J., Combes, V., Gramaglia, I., Grau, G. E. A unified hypothesis for the genesis of cerebral malaria: sequestration, inflammation and hemostasis leading to microcirculatory dysfunction. Trends. Parasitol. 22, 503-508 (2006).
- Dorovini-Zis, K., Prameya, R., Bowman, P. D. Culture and characterization of microvascular endothelial cells derived from human brain. Lab. Invest. 64, 425-436 (1991).
- Rowe, J. A., Claessens, A., Corrigan, R. A., Arman, M. Adhesion of Plasmodium falciparum-infected erythrocytes to human cells: molecular mechanisms and therapeutic implications. Expert reviews in molecular medicine. 11, e16-e16 (2009).
- Xiao, L. Plasmodium falciparum: involvement of additional receptors in the cytoadherence of infected erythrocytes to microvascular endothelial cells. Exp. Parasitol. 84, 42-55 (1996).
- Corrigan, R. A., Rowe, J. A. Strain variation in early innate cytokine induction by Plasmodium falciparum. Parasite. Immunol. 32, 512-527 (2010).
- Rowe, J. A. Implications of mycoplasma contamination in Plasmodium falciparum cultures and methods for its detection and eradication. Mol. Biochem. Parasitol. 92, 177-180 (1998).
- Moll, K., Ljungström, I., Perlmann, H., Scherf, A., Wahlgren, M. . Methods in Malaria Research. , (2009).
- Lambros, C., Vanderberg, J. P. Synchronization of Plasmodium falciparum erythrocytic stages in culture. J. Parasitol. 65, 418-420 (1979).
- Herricks, T., Antia, M., Rathod, P. K. Deformability limits of Plasmodium falciparum-infected red blood cells. Cell. Microbiol. , (2009).
- Nakamura, K., Hasler, T., Morehead, K., Howard, R. J., Aikawa, M. Plasmodium falciparum-infected erythrocyte receptor(s) for CD36 and thrombospondin are restricted to knobs on the erythrocyte surface. J. Histochem. Cytochem. 40, 1419-1422 (1992).
- Wassmer, S. C., Cianciolo, G. J., Combes, V., Grau, G. E. LMP-420, a new therapeutic approach for cerebral malaria. Med. Sci. (Paris). 22, 343-345 (2006).
- Wassmer, S. C., Combes, V., Candal, F. J., Juhan-Vague, I., Grau, G. E. Platelets potentiate brain endothelial alterations induced by Plasmodium falciparum. Infect. Immun. 74, 645-653 (2006).
