Sélection des Plasmodium falciparum Parasites des Cytoadhesion aux cellules du cerveau endothéliales humaines

Les recommandations générales Microvasculaires humaines du cerveau des cellules endothéliales (HBEC-5i) la culture a été précédemment décrit en 6, 8. P. falciparum ont été cultivées comme dans 9. Les deux HBEC-5i et P. falciparum cultures parasitaires doivent être conservés dans des conditions stériles en tout temps. Tous les réactifs doivent être pré-chauffé à 37 ° C. Nous vous recommandons de consulter régulièrement pour contamination par des mycoplasmes par PCR 10 (Minevera Biolabs, les instructions du fabricant de). Le protocole est résumé dans la figure 1. 1. Endothéliales de la culture cellulaire de routine Préparer les réactifs nécessaires. Moyen de se préparer Réactifs Quantité «Incomplète DMEM" DMEM-F12 de Ham 500ml &nbsp; L-glutamine 200 mM 5ml Pénicilline / streptomycine 100X 5 ml NaOH 1M 1,3 ml (ajuster le pH à 7,4) "DMEM complet" «Incomplète DMEM" 450ml Fœtale sérum bovin inactivé à la chaleur 50ml Endothéliale supplément de croissance cellulaire 5 ml Culture HBEC-5i dans un ventilé 25cm 2 flacon avec 10ml milieu DMEM complet dans un incubateur à 37 ° C avec 5% de CO 2. Passage des cellules quand elles deviennent confluentes. Enlevez l'ancien milieu par aspiration et laver deux fois avec du milieu DMEM incomplet ou de culture de tissus de qualité PBS (Ca 2 + et Mg 2 + libre) de pré-chauffé à 37 ° C. Ajouter 1ml de pré-chauffé EssayezPSIN-EDTA (0,025% de trypsine, 0.5mm EDTA), tourbillon de couvrir la totalité du flacon et incuber pendant ~ 2 min à 37 ° C. Vérifiez sous microscope inversé qu'au moins 90% des cellules ont été détachées. Si nécessaire, doucement frapper le fond du flacon pour déloger les cellules adhérentes. Ajouter 10 ml de milieu DMEM complet de bloquer les cellules de la trypsine et transférer dans un tube 15ml conique. Centrifuger pendant 4 min à 300 g à température ambiante (RT). Jeter le surnageant et remettre le culot avec 10 ml de milieu DMEM complet. Pipeter la solution de haut en bas pour bien remettre les cellules. Ajouter 1 ou 2 ml de la suspension cellulaire dans un flacon de culture et d'ajouter de nouveaux 8ml de milieu frais pour maintenir la culture. Évaluer la croissance de la culture tous les jours sous un microscope inversé et changement de milieu tous les 2 ou 3 jours avant qu'il devienne jaune. 2. Préparation des cellules endothéliales pour une sélection Deux jours avant le jour de la sélectio n, ajoutez la fibronectine dilué dans du PBS stérile (2 pg / cm 2) dans un (ou plusieurs) de 60 mm boîte de Petri. Incuber le plat pendant 5 à 20 min à 37 ° C, puis retirez la solution de fibronectine, qui peuvent être conservés à 4 ° C pendant un mois et réutilisés une fois. Passage des cellules comme décrit dans les sections 1.3. à 1,5. En supposant que 100% des cellules confluentes ont été détachées et remises en suspension dans 10ml milieu DMEM complet (section 1.6., Resuspendre avec un volume équivalent de milieu si la confluence est plus faible, par exemple resuspendre avec 8ml si la confluence a été de 80%), ajouter 1,5 ml de la suspension cellules à la boîte de Pétri fibronectine revêtement et un autre 1,5 ml de milieu DMEM complet. Placer le plat de Pétri ensemencés dans l'incubateur. Note: Idéalement, la confluence se situera autour de 90% au moment de la sélection de deux jours plus tard. Facultatif. Pour activer HBEC-5i, ajoutez le TNF (facteur de nécrose tumorale) des cytokines à une concentration finale de 50μg/ml 24 heures avant la sélection. e_title "> 3. Plasmodium falciparum culture de routine Préparer les réactifs nécessaires (voir tableau ci-dessous). Préparer des globules rouges (RBC) en séparant le sang entier (groupe O +) par passage à travers un filtre déleucocytation (voir «Méthodes de recherche sur le paludisme" publication 11 pour la malaria parasites en culture générale). Laver deux fois par RBC par centrifugation à 400 g pendant 5 min et les remettre en suspension avec 10 ml de RPMI incomplète. Gardez lavés RBC à 4 ° C dans un milieu incomplet à l'hématocrite de 50%. Moyen de se préparer Réactifs Quantité «Incomplète RPMI" RPMI 1640 (avec du bicarbonate) 500ml Hepes 1M 12,5 ml Glucose 20% 5ml </td> L-glutamine 200 mM 5ml Gentamycine 50mg/ml 250μl NaOH 1M 0,7 ml (ajuster le pH à 7,2) «RPMI complet" «Incomplète RPMI" 450ml Pooled humaine (non-immunes) de sérum 50ml Culture P. falciparum infectés RBC avec un milieu RPMI complet à l'hématocrite de 2% et incuber à 37 ° C avec 3% de CO 2, 1% O 2, et 96% de N 2. Faire frottis au Giemsa 11 quotidiens afin d'évaluer le stade de développement des parasites (figure 2). Régulièrement (environ une fois par semaine) de synchroniser la culture par le traitement de sorbitol 12. Le jour avant le test de sélection, afin d'une culture au stade annulaire parasitémie 5% ou plus (idéalement au moins une0%). 4. Sélection de P. falciparum cytoadhesion aux cellules endothéliales Le jour du test, la culture de parasites doivent être au stade trophozoïte pigmentée (figure 2) (idéalement parasitémie de 10%) tandis que HBEC-5i la culture doit être de 50 à 100% de confluence (idéalement 90%). 30μl hématocrite de la culture de parasites est nécessaire par HBEC-5i boîte de Pétri. Lavez les parasites à deux reprises par centrifugation (500 g pendant 5 min) 1.5ml de la culture du parasite. Rejeter le surnageant et resuspendre avec 10ml de fraîchement préparé, réchauffé, du milieu DMEM incomplète. Répétez la laver une seconde fois. Reprendre le volume cellulaire 30μl emballé avec 1.5ml d'incomplet avec 1% de BSA DMEM. Laver la vaisselle HBEC-5i revêtement de Petri à deux reprises aspirant moyen et ajouter 3 ml de DMEM incomplète. Ajouter la solution de parasites à l'antenne HBEC-5i et incuber à 37 ° C pendant 75min. Resuspendre les parasites deux fois (après 30 et 60 min) pendant l'incubationen secouant délicatement le plat dans les quatre directions, ainsi que dans le sens horaire et anti-horaire. Après incubation, laver la vaisselle 5 fois en aspirant moyen, en utilisant une pipette Pasteur en plastique à ajouter 3 ml de milieu DMEM chaudes incomplètes, et doux balancement. Si de nombreux plats sont utilisés, les garder sur une surface chaude, comme un grand flacon rempli d'eau à 37 ° C. Vérifiez le plat sous un microscope inversé. Si de nombreux infectés RBC sont encore visibles, faire plus de lave comme décrit ci-dessus. Manipuler la boîte de Pétri très soigneusement pour éviter tout risque de contamination. Retirer moyennes du plat et ajouter 3ml de milieu RPMI chaud complet avec le volume des cellules 40μl emballée d'uRBC frais. Placer le plat dans une chambre hermétique incubation, de gaz pendant 3 min et le lieu de la chambre dans un incubateur à 37 ° C pendant la nuit. Le lendemain, la récolte des parasites par un lavage avec du milieu RPMI incomplète, d'une manière similaire à celle décrite à la section 4.4. mais plus vigoureusement. Keep tous les moyens utilisés (contenant resuspendues RBC) dans un tube 15ml conique. Vérifiez sous microscope inversé que tous les RBC ont été retirés de l'antenne. Pellet, les parasites, jeter le surnageant, remettre en suspension dans un milieu RPMI complet et 5ml placer le mélange dans un flacon de culture normaux. 5. Les résultats représentatifs Les parasites non sélectionnés présentent un faible niveau de se lier à HBEC-5i (figure 3A). Ainsi, après le premier tour de sélection, des parasites très peu seront récoltés et cela peut prendre jusqu'à un mois de culture pour atteindre une parasitémie suffisante pour le second tour de sélection. Après chaque tour de sélection, les parasites de plus en plus de se lier aux cellules endothéliales et les sélections peut être répétée à intervalles de temps plus courte. Après 4-5 tours de sélection, les populations de parasites à haute liaison sont obtenus (figure 3). Dans nos mains, la liaison du HB3-HBEC d'HBEC-5i ou TNF activée HBEC-5i était de simniveau de ILAR (données non présentées). Le protocole décrit ici a été testé avec 4 p. falciparum: HB3, IT/FCR3, 3D7 et DD2 (tableau 1). Seul ce dernier s'est avéré incapable de se lier à HBEC-5i, même après 5 rondes de sélection. HB3 les parasites ont également été sélectionnés pour cytoadhérence à l'homme cutanée et pulmonaire cellules endothéliales microvasculaires (HDMEC et HPMEC). Après quatre cycles de sélection, en utilisant la méthode décrite ici, une population à haut contraignant a été obtenu sur les deux HDMEC et HPMEC (figure 4). Figure 1. Aperçu du processus de sélection. Figure 2 phases de développement. De P. falciparum globules rouges infectés. Frottis au Giemsa visualisés au microscope à un grossissement de 1000X. Figure 3. Exemple typique de parasites liant à HBEC-5i. (A) La couche bleue est HBEC-5i fixé avec du glutaraldéhyde et colorées au Giemsa, visualisés au microscope à un grossissement de 1000X. Les photos ont été prises après la CISR uRBC et non liées ont été emportés. Le panneau de gauche montre un seul p. falciparum HB3 (non sélectionné) du parasite lié à HBEC-5i. Dans le panneau de droite, les parasites HB3-HBEC avait été sélectionné pour 5 tours. (B) Les données représentent la moyenne de deux expériences indépendantes, chacune réalisée en double. Le nombre de parasites liés par des cellules endothéliales a été compté. Tableau 1. Résumé des souches de Plasmodium falciparum qui ont été sélectionnées avec succès pour la liaison à HBEC-5i. Notez que HB3 a également été sélectionné sur le TNF-activé HBCE-5i. Après 5 rondes de sélection, la souche DD2 n'a montré aucune augmentation dans la liaison au HBEC-5i comparé à désélectionné-DD2. Figure 4. Reliure de P. falciparum HB3 parasites dermiques (HDMEC) et pulmonaires (HPMEC) des cellules endothéliales, avant et après 4 tours de sélection. Bien que le milieu de culture pour HDMEC et HPMEC diffère légèrement (voir les instructions du fournisseur), le protocole utilisé pour la sélection a été identique à celle des HBEC-5i. Photos prises à un grossissement de 400x. Nom du réactif Société Numéro de catalogue Commentaires DMEM-F12 de Ham Sigma D6421 Pour milieu DMEM complet L-glutamine 200 mM GIBCO 25030 Pour un milieu DMEM et RPMI complet Pénicilline / streptomycine 100X (10000 unités / ml et 10mg/ml) ScienCell 0503 Pour milieu DMEM complet Fœtale sérum bovin inactivé à la chaleur ScienCell 0025 Pour milieu DMEM complet Trypsine-EDTA (0,025% de trypsine, 0.5mm EDTA) ScienCell 0103 Endothéliale supplément de croissance cellulaire ScienCell 1052 Pour milieu DMEM complet La culture de tissus traités 60 mm x 15 mm boîte de Pétri BD 353002 Fibronectine humaine Millipore FC010 Utilisez à 2 pg / cm 2 TNF R &D Systems 210-TA en option, utilisation à 50 pg / ml RPMI 1640 Lonza BE12-167F Pour un milieu RPMI complet Gentamycine 50mg/ml Lonza 17-518Z Pour un milieu RPMI complet Hepes 1M Lonza BE17-737E Pour un milieu RPMI complet HDMEC ScienCell 2000 Lignée cellulaire primaire HPMEC ScienCell 3000 Lignée cellulaire primaire HBEC-5i Obtenu à partir de Francisco Candal (fcandal@cdc.gov) Tableau 2. Matériaux