סידן הדמיה של ריח עוררו התגובות תסיסנית מחושים האונה

1. חסום הרכבה האסיפה גוש פרספקס גובר (איור 1 א) צריך להיעשות כדי המפרט המדויק שניתנו תוכנית (זמין http://neuro.uni-konstanz.de/j ove_mountingblock_blueprint / ) על מנת לאפשר התקנה קלה ו הנתיחה של זבוב. נושא דרך הברגים בחזרה, אך לא להאריך אותם מעבר לחזית הרחוב, את עמדתם יותאמו במהלך תקופת ההכנה של בעל החיים (ראה 2.7). באמצעות תרגיל דיוק, לעשות שקע הגבול העליון של חדר עגול על זבוב, לחפור מתחת לפני השטח כדי לפנות מקום לגוף של זבוב, הקטנת עובי של הגוש בנקודה זו. גזור רשת נחושת עם הניצב אזמל וקרוב בתחתית החריץ כדי ליצור "צווארון". ודא כי שני מדפים וכתוצאה מכך הם ברמה, כמו זה יעזור הכניסה של הזבוב. עם קיסם, הנח טיפה קטנה של דבק מגע על גבי בלוק גובר מעל החדר העגול של זבוב. מניחים את הרשת על גבי נחושת דבק ואת המיקום, כך חריץ מתמקדת בלוק (איור 1 א). לחץ כלפי מטה בעדינות להסיר דבק עודף. עם זוג פינצטה, להוסיף טיפות זעירות של דבק תחת דשי בכל צד ו לקפל את הרשת על החלק הקדמי של גוש כך חריץ מצביע כלפי מטה ישרים. ודא גבי הרשת היא בגובה הרחוב. אפשר להתייבש לחלוטין. הרכב בעל חוט: לחתוך coverslip הפלסטיק במחצית ולהסיר חלק מרכזי לעשות "U" הצורה. השתמש שעוות דבורים להדביק חתיכת חוט לרוחב החלק העליון של "U", לא מעבירים חוט מתוח מדי. לבנות את חומת מחושים: עושים חור coverslip פלסטיק עם נייר חור אגרוף. חתוך את הקצוות של coverslip ל 0.5 x 0.7 ס"מ. דבק פלסטיק coverslip נרצע סרט דביק ולאחר מכן למקם ירידה של אתנול בקלטת נחשף דרך החור כדילהסיר את הדבק. 2. בעלי חיים הכנה זבובים של גנוטיפ המתאים – כלומר הנושא את השילוב הרצוי של "הנהג" ו פעילות הכתב transgenes – צריך להיות בן 1-3 שבועות; לציפורן של זבובים צעירים יותר רך מדי, קשה לחתוך. כאשר ניסויים דורשים השוואה ישירה של גנוטיפים שונים, כדי להתאים את רמות ביטוי transgene, זבובים צריך להיות בגיל בהתאמה להימנע הקשורות לגיל הבדלים פיזיולוגיים. אם מין לא חשוב, אנחנו מעדיפים להשתמש זבובים נשים שכן יש להם ראשים גדולים יותר, קל יותר לתמרן. להרדים זבובים על ידי קירור על הקרח. להכניס זבוב אחד לבלוק גובר. החזק את הזבוב על ידי מפרק הזרוע והחלק אותו, הגב, משטח 1, לאורך החריץ של רשת נחושת כך שהוא מושעה על ידי צוואר (איור 1 ב-C). אם יש צורך, לסובב אותו עד שהוא מביט למטה. מניחים עמוד השדרה קקטוס בסדר מול Fly של הראש כדי למנוע ממנה לברוח (איור 1 ב-C). מניחים את עמוד השדרה קקטוס מול חוטם כדי למנוע ממנו לזוז. לתקן את עמוד השדרה קקטוס לבלוק באמצעות שעוות דבורים. ודא כי הראש הוא בגובה החלק העליון של הרחוב. תקן ראש לטוס לבלוק עם טיפה קטנה של רוזין (מומס אתנול). מניחים את גוש בתיבת humidified ולאפשר רוזין להתקשות במשך שעה בערך. באמצעות מלקחיים, למשוך את הצלחת מחושים קדימה ושחרר את החוט על בעל (שעווה בצד החוצה, ראה 1.5) על פי cuticular בין האנטנה לבין הראש. תקן בעל לחזית הרחוב עם שעוות דבורים. באמצעות ברגים המובנים בלוק, בעדינות בעל חוט קדימה כדי ליצור כמה רווח בין הצלחת מחושים וראש. מניחים את המגן מחושים (ראה 1.6) מעל ראשו של זבוב עם חור בעמדה מרכזית. תקן עם שעוות דבורים לחלק העליון של הבלוק גובר. באמצעות סכין, ספליטר, Cuת"א חור קטן קלטת המגן על חשיפת לציפורן של ראשו של זבוב מאחורי האנטנה. חור לא צריך להרחיב מעבר לעיניים כדי למנוע הכנת מ דולף. לאטום את החור בין הסרט לבין לציפורן עם סיליקון דו רכיבי. הסר את כל עודפי הסיליקון מהחלק העליון של ראשו של זבוב. מניחים ירידה של תסיסנית הצלצול של מי מלח (130 mM NaCl, KCl 5 מ"מ, 2 מ"מ MgCl 2, 2 מ"מ CaCl 2, 36 מ"מ saccharose, 5 HEPES מ"מ, ה-pH 7.3) על הראש. לוודא שאין נזילות: אנטנות צריך להישאר יבש לחלוטין. באמצעות סכין ספיר, לחתוך חור לציפורן. ראשית, קל ציון לאורך הקפל cuticular ישירות מאחורי האנטנה, ואז לחתוך לאורך ולרוחב העיניים ocelli על הגב. לבסוף, לקפל את פיסת העור המת מעבר לקצה כבש לחתוך מן החלק התחתון, כדי למנוע ניתוק העצבים מחושים. מוציאים בזהירות את הבלוטות ואת קנה הנשימה עם פינצטה בסדר. יש לשטוף מספר פעמים עם תסיסנית </em> של הצלצול, משאירה טיפה גדולה על הראש. 3. Stimulus ריח משלוח מזרקים ריח: להוסיף כרית תאית לתוך מזרק פלסטיק 2 מ"ל עם מלקחיים נקיים פיפטה על זה (בעזרת טיפים סינון) 20 μl של ריח, בדילול כפי הרצוי ממס מתאים, באמצעות קצה פיפטה לדחוף את משטח עמוק לתוך החבית . הכנס מכסה את המזרק עד נדרש. דילולים ריח טריים יש להכין לפחות כל 3 חודשים (או בתדירות גבוהה יותר על ריחות נדיפים מאוד ו / או לעיתים קרובות בשימוש), ו רפידות חדשות צריך להיות מוכנים מזרקים ריח פשוט לפני כל פגישה ההקלטה. אין להשתמש בכריות ריח יותר משלושה גירויים, שכן ריכוז הריח עלול להירקב. מחוייט olfactometer (איור 2): זרם אוויר העיקרית (1 ליטר / דקה) מכוונת דרך צינורות טפלון (בקוטר 0.4 מ"מ פנימי), 27 ס"מ במעלה הזרם של יציאה של צינור זה, זרם האוויר המשני (1 ליטר / דקה ) הוא הוסיף. שני זרמי אוויר שנוצר על ידי המשאבות בממברנה, ושיעור הזרימה מווסתת על ידי שני flowmeters עצמאיים. זרמי האוויר יכול להיות humidified ידי עובר דרך מים בבקבוקים גז כביסה, אם כי יש להיזהר כדי למנוע יתר humidification (כלומר יותר מ 60% ~). זרם אוויר משני מכוונת או באמצעות מזרק ריח או מזרק ריק: מזרקים מחוברים זרימת אוויר באמצעות מחט מזרק (1.2 מ"מ קוטר חיצוני) חודרות הבוכנה. שסתום 3 כיווני מגנטי נשלט באמצעות יחידת שסתום הבקרה (למשל VC6 הרווארד התקנים) משמש כדי לעבור בין אוויר נקי גירוי הריח. 4. בחי הדמיה המתואר כאן דימות באמצעות מיקרוסקופ פלואורסצנטי זקופה (למשל קבוע זקוף שלב צייס Axio D1 הבוחן) מצויד המטרה 20x מים (למשל Zeiss W "תוכנית-Apochromat" 20x / 1,0 M27 DIC) (איור 2). הדמיה עם G-המחנה (עירור / פליטה: 488/509 ננומטר), יש להשתמש במסנן בלוק עם המאפיינים הבאים: 450-490 עירור במסנן ננומטר, Dichroic במראה (T495LP) ו – 500-550 ננומטר פליטת מסנן (Chroma ET). מניחים את גוש הרכבה המכיל את הזבוב מתחת למיקרוסקופ. מקם את יציאתם של כ 0.5 ס"מ olfactometer מול האנטנות של זבוב. מנמיכים את המטרה עד שהוא נוגע פתרון של רינגר על ראשו של זבוב. לעבור הצופה תחת תאורה בהירה שדה, עמדה להכנת כך חור הקפסולה הראש מרוכז וגבולותיה הם בפוקוס. לעבור באור ניאון ולהתאים את המיקוד עד שאתה יכול לראות את הנוירונים שכותרתו (לכאורה מן פלואורסצנטי ירוק הבסיסי של ה-G-cAMP). פוקוס מצוין על glomeruli עניין באמצעות רכישת תמונות עם מכשיר חיוב מצמידים (CCD) המצלמה (למשל CoolSNAP-HQ2 מערכת מצלמה דיגיטלית) רכוב על מיקרוסקופ באמצעות תוכנת הרכישה המתאימה (למשל Metafluor) (איור 3 א). סגור את הסרעפת בנתיב האור תאורה להגביל אור עירור לאזור הדמיה. להקלטת ריח עוררהפעילות, הגדר את קצב רכישת הרץ 4 ולהתאים את זמן החשיפה כדי להשיג ערכי הקרינה בטווח הדינאמי של המצלמה שלך CCD, אך לא נמוך יותר מאשר 1000 (יחידות שרירותיות), עם רזולוציה של 12-bit לפחות דינמית. זמן החשיפה לא יעלה על 100 MS, במידת האפשר, כדי להפחית את ה-G-מחנה photobleaching. אם הרזולוציה המרחבית של המצלמה מאפשרת, ניתן להגדיל את binning (מספר בארות על שבב זה יהיה זרקת לפח לתוך פיקסל 1 דיגיטלי) כדי לצמצם את זמן החשיפה. אנו מקבלים תמונות של 350×225 פיקסלים (עם binning של 2×2), המקביל ל 210×135 מיקרומטר על ההכנה. הגדרות אלה הם אופטימליים כדי ללכוד את ריח המושרה גלומרולרי התגובות של מחנה G עם רזולוציה במרחב ובזמן טוב תוך הגבלת כתב הלבנה. הגדר את פרמטרי מידות. אנחנו בדרך כלל לרשום למשך 10 שניות (כלומר 40 מסגרות), עם גירוי ריח בדרך כלל מתחיל 4 שניות לאחר תחילת תקופת הרכישה (מסגרת 15) ו – 2 לאורך 1 (until מסגרת 19). הכנה זבוב בדרך כלל, ניתן לבדוק עם עד 25-30 גירויים ריח שונים, מוגבל לעתים קרובות על ידי ירידה בלתי הפיך אות הניאון של הכתב בשל photobleaching. מרווח בין גירוי יהיה תלוי בעוצמת התגובה נצפתה ושיעור photobleaching. אורך מתאים של מרווח בין גירוי, כדי למנוע עיבוד חושי יכולים להיקבע על ידי כ מצגת חזר על ריח בקרה חיובית (אם ידוע) בניסויים המשפט. הכללה של ריח זה כל ~~~HEAD=NNS 10 גירויים בסדרה נתון יכול לאפשר אימות של כדאיות המשך ותגובה עקבית של הכנה. 5. עיבוד נתונים וניתוח הנתונים מעובדים באמצעות ImageJ (עם מק Biophotonics התוספת, www.macbiophotonics.ca ) ותוכניות שנכתבו מותאמים אישית Matlab ו-R באופן הבא: לתקן חפצים התנועה לדוגמה:ליישר את כל התמונות המתאימים להכנת חיה אחת (למשל 30 מדידות של 40 מסגרות כל אחת) באמצעות "גוף קשיח" מצב של StackReg / TurboReg ( bigwww.epfl.ch / thevenaz / stackreg ) ב ImageJ. צעד זה נדרש להסיר משמרות בעמדה של הנוירונים שכותרתו לגבי מסגרת הרכישה בתוך ובין מדידות. עם זאת, אפשר רק להסיר את השינויים במישור xy. הנתונים אמור להיות מושלך אם השינויים חזקים מוקד להתרחש. קטע מחסנית לתוך מדידות של 10 שניות (40 מסגרת) בודדים. הנכון עבור הלבנת חפצים: החשיפה לאור ניאון יגרום הקרינה להירקב בזמן המדידה אחת 10. במקרים מסוימים, חשוב לתקן את הריקבון הזה לפני ניתוח הנתונים. עבור כל מדידה לחשב את המסגרת ברקע. זה צריך להיות הממוצע של מספר פריימים לפני הופעת הגירוי (כגון מסגרות 6-14). מחלקים כל מסגרת על ידי backg זהסביב מסגרת לקבל את השינויים הקרינה יחסית. לחשב את הערך הממוצע הקרינה היחסית עבור כל מסגרת על ידי ממוצע של כל הפיקסלים בתוך השטח המסומן על ידי G-מחנה. התאמה מעריכית כפולה עקומת הקרינה הממוצעת, נותן משקל חזק יותר את המסגרות לפני הגירוי ואפס משקל לזמן התגובה ריח (20 מסגרות לאחר הופעת גירוי במקרה שלנו). להפחית את עקומת מצויד מעקום הקרינה היחסית של כל פיקסל. הכפל את המסגרות לתקן על ידי המסגרת את הרקע מחדש להשיג את הנתונים הגולמיים. זה סוג של תיקון עלול להוביל שינוי בדינמיקה תגובה אם האות לא לחזור לקו הבסיס עד סוף המדידה (למשל, אם התגובות מעכבות או מעוררות חזקה מאוד הם עוררו) (איור 4). בעוד תיקון של חפצים הלבנת שימושי במקרים רבים, פרשנות של פרמטרים הזמני צריך להיעשות בזהירות אם תיקון אקונומיקה מוחל. חשב את השינוי היחסי הקרינה (& דהlta: F / F) עבור כל מסגרת של כל מדידה כמו (F i-F 0) / נ 0 * 100, שם F 0 הוא מסגרת רקע (ראו 5.3), ו-F i את הערך הקרינה למסגרת אני ה של המדידה. לחשב את הממוצע ΔF F / בתוך אזור חוזר של עניין glomerulus (איור 3 ב) בקוטר של 10 פיקסלים על מנת להשיג עקבות פעילות (5 א 'איור). אם רוצים, להפוך את עקבות לתוך heatmaps באמצעות ImageJ (5 א 'איור). חשב את המשרעת שיא של תגובה על ידי הפחתת ΔF אומר / F של ארבע מסגרות לפני גירוי ΔF אומר / F של ארבע מסגרות בזמן שיא של תגובה. הליך דומה משמש גם כדי להמחיש דפוסי התגובה מרחביים (ראה איור 3 ב) ו לכמת את משרעת התגובה באזורים ספציפיים של עניין על פני זבובים (ראה איור 5 ב). בתגובה לשיא ניתן לכמת באמצעות שילוב אזור מתחת עקומת בזמן הגירוי, או averaginגרם מסגרות ברחבי המרבי של תגובה. 6. נציג תוצאות השתמשנו בפרוטוקולים לעיל כדי להקליט ולנתח תגובות חומצה עוררו propionic של זבובים המבטאים G-28 CaMP1.6 בשליטת היזם על חוש הריח שיתוף הקולטן IR8a, הפועלת בקרב אוכלוסיות שונות של OSNs (29,30 דמויות 3-5). גירוי עם חומצה propionic 1% מעורר עליות הקרינה G-מחנה – המעיד על עליית סידן תוך תאי – ב OSNs innervating 2 glomeruli, DC4 ו DP1l (איור 3 ב). אנו מדגימים דרכים שונות לייצג נתונים זבובים מרובים איור 5: פעילות קו עקבות, heatmaps ואת העלילה בר התגובות השיא. תגובות Propionic חומצה עוררו יש אמפליטודות השיא שונים ודינמיקה הזמני DC4 ו DP1l. יתר על כן, למרות התגובות הם בדרך כלל חזקים, השונות בין בעלי החיים הבודדים יכול להיות גם ציין הן glomeruli (ראה הואatmaps ב 5 א איור). כימות התגובות השיא (איור 5 ב) מאפשר השוואה סטטיסטית פשוטה בין glomeruli שונים odorants שונים על פני בעלי החיים. עם זאת, ריח עוררו תגובות סידן יכולה להיות לא אחידה הדינמיקה הזמני, וכימות בסדר גודל שלהם עם ערך אחד יתעלמו מורכבות זו. באיור 1. סכמטי של גוש גובר (א ') לפני (ב) לאחר המבוא של זבוב, ו (ג) למעלה צפה ב תקריב (עיבוד 31). איור 2. סכמטי של הניסוי הגדרת. איור 3. () צפו לראש הכנה זבוב אחר צעד 2.8 (פאנל משמאל) ותמונה הקרינה הגלם של אנטההאונות NNAL תווית עם G-CaMP1.6 (גנוטיפ: האמרגן IR8a: GAL4, כטב"מ: G-CaMP1.6). DC4 ו DP1l glomeruli ניתן להבחין על ידי גודלן, המורפולוגיה מיקום מסומנים באדום וכחול, בהתאמה. (ב) קוד הצבעים בתמונה התגובה לחומצה propionic (1% V / V). הדימוי המתאים ΔF / F של הפסגה התגובה מחושב כמוסבר בשלב 5.6 (ראה גם ציור 5a). Colorscale בצד שמאל מציין את הערך ΔF / F%. העיגולים השחורים מציינים את המיקום והגודל של אזור עניין בשימוש לכמת את התגובות (ראה איור 5). איור 4. תיקון הלבנת האות כתב ניאון. דוגמאות של ההשפעה של תיקון אקונומיקה כמתואר בשלב 5.3. נתונים לדוגמה בלוח השמאלי ניתן לתקן ללא שינויים משמעותיים בצורת התגובה. נתונים לדוגמה בלוח השמאלי הוא קשה להשפיעאד על ידי תיקון אקונומיקה, סביר להניח כי האות יורדת ומתוחזק מתחת לקו הבסיס לאחר סיום גירוי הריח. איור 5 (א) למעלה. הדינמיקה הזמני של התגובות של סידן glomeruli DC4 (משמאל) DP1l (מימין) לחומצה propionic (1% V / V). את עקבות שחורים להראות החציוני של ΔF F אומר / בתוך אזור של אינטרס (ראה איור 3 ב) על פני שמונה בעלי חיים. השטח האפור מציין את הטווח בין quartiles הראשון והשלישי של ההפצה. הצגת ערכי חציון ברבעון מספק מידע נוסף על השתנות והפצה של התגובות שנצפו מ השגיאה רשע רגיל. את תיבות ירוק אדום עולה המסגרות בממוצע לחשב את התגובות השיא שמוצג באיור 3 ב, ו לכמת ב 5 ב איור. למטה: heatmaps מראים הנתונים התגובה לכל חיות בודדים בשורות נפרדות, עם ΔF / F ערכים represented ידי colorscale (הימין הקיצוני). את פסים שחורים אופקיים לציין את משך הזמן של הגירוי. (ב) תגובות שיא החציוני חומצה propionic על פני שמונה חיות DC4 ו DP1l glomeruli. הברים מציינים את טווח השגיאה בין quartiles הראשון והשלישי של ההפצה.