Imagens de cálcio de odor-provocou respostas no Drosophila Lobo antenal

1. Assembléia Bloco de Montagem O bloco de montagem plexiglass (Figura 1A) deve ser feita com as especificações exactas dadas no plano (disponível a partir http://neuro.uni-konstanz.de/j ove_mountingblock_blueprint / ) Para permitir a fácil montagem e dissecção da mosca. Fio através dos parafusos da parte de trás, mas não se estendem para além da frente do bloco; sua posição irá ser ajustada durante a preparação do animal (ver 2.7). Usando uma broca de precisão, fazer um dente na borda superior da câmara circular para a mosca, escavando sob a superfície para dar espaço para o corpo da mosca, a redução da espessura do bloco neste momento. Cortado numa grelha de cobre com um bisturi e perpendicular perto do fundo da fenda para criar um "colarinho". Certifique-se que as duas abas resultantes são de nível, pois isso irá ajudar a inserção da mosca. Com um palito, coloque uma pequena gota de supercola para o bloco de montagem acima da câmara circular para a mosca. Coloque a grelha de cobre para a cola e posição de modo que a fenda está centrada sobre o bloco (Figura 1A). Pressione delicadamente e remover qualquer excesso de cola. Com um par de pinças, adicionar pequenas gotas de cola sob as abas de cada lado e dobrar a grade sobre a frente do bloco de modo que a fenda está a apontar para baixo rectas. Assegure-se no topo da grade é nivelada com o bloco. Deixar secar completamente. Montar um suporte de fio: corte uma lamela de plástico ao meio e retire uma peça central para fazer um "U". Use cera para colar um pedaço de arame na parte superior do "U", não faça o fio muito esticado. Construir o escudo da antena: fazer um buraco em uma lamela de plástico com um furador de papel. Aparar as extremidades da lamela para 0,5 x 0,7 cm. Cole a lamela perfurado plástico para fita adesiva e, em seguida, coloque uma gota de álcool na fita exposta pelo buraco pararemover o adesivo. 2. Preparação dos animais As moscas do genótipo adequado – ou seja, tendo a combinação desejada de "driver" e atividade reporter transgenes – deve ser de 1-3 semanas de idade, a cutícula de moscas mais jovens é muito mole e difícil de cortar. Quando as experiências requerem comparação directa de genótipos diferentes, e de modo a corresponder níveis de expressão do transgene, moscas deve ser idade correspondente para evitar relacionadas com a idade diferenças fisiológicas. Se o género não é importante, nós preferimos usar moscas fêmeas uma vez que têm cabeças maiores e são mais fáceis de manipular. Anestesiar moscas por arrefecimento em gelo. Introduzir uma única mosca no bloco de montagem. Mantenha a mosca pelo conjunto de asa e deslize-, dorsal de superfície em primeiro lugar, ao longo da fenda da grelha de cobre de modo que é suspensa pela seu pescoço (Figura 1B-C). Se necessário, gire-o até que ele está olhando para baixo. Colocar uma espinha fina cacto na frente do fly cabeça do para evitar que se escape (Figura 1B C-). Coloque a coluna cacto na frente dos probóscide para evitar que ela se mova. Fixar a coluna cacto para o bloco usando cera de abelha. Assegure-se que a parte superior da cabeça é nivelada com o topo do bloco. Fixar a cabeça da mosca para o bloco com uma pequena gota de colofónia (dissolvido em etanol). Colocar o bloco dentro de uma caixa humidificada e permitir que a colofónia para endurecer durante cerca de uma hora. Usando uma pinça, puxe a placa da antena para a frente e soltar o fio no suporte (cera lado-out; ver 1.5) na prega cuticular entre a antena ea cabeça. Fixar o suporte para a frente do bloco com cera de abelha. Usando os parafusos embutidos no bloco, empurre o suporte do fio para a frente para criar algum espaço entre a placa da antena ea cabeça. Coloque a blindagem antenal (ver 1,6) sobre o topo da cabeça da mosca com o furo posicionado centralmente. Fixar com cera de abelha para o início do bloco de montagem. Usando uma lâmina divisor, cuta pequeno orifício na fita sobre o escudo expondo a cutícula da cabeça da mosca por trás da antena. O buraco não deve se estender além dos olhos para evitar a elaboração de vazamento. Selar o furo entre a fita ea cutícula com dois componentes de silício. Remova qualquer excesso de silício a partir do topo da cabeça da mosca. Colocar uma gota de solução salina (130 mM de NaCl, 5 mM de KCl, 2 mM de MgCl2, 2 mM de CaCl2, 36 mM de sacarose, 5 mM de HEPES, pH 7,3) na cabeça de Drosophila de Ringer. Certifique-se que não há vazamentos: as antenas devem ficar completamente seco. Usando uma lâmina de safira, cortar um furo na cutícula. Em primeiro lugar, levemente pontuação ao longo da dobra cuticular directamente por trás da antena, em seguida, cortado ao longo dos olhos e em toda a ocelos na parte traseira. Finalmente, dobram o pedaço de cutícula sobre a borda marcados e cortado a partir do lado de baixo para evitar a separar os nervos antenais. Retire cuidadosamente as glândulas e traquéia, com uma pinça fina. Lavar repetidamente com Drosophila </em> Ringer, deixando uma grande queda na cabeça. 3. Entrega do estímulo Odor Seringas odor: inserir uma almofada de celulose para uma seringa de plástico de 2 ml com uma pinça limpas e pipeta-o (utilizando pontas de filtro) 20 ul de odor, diluídas conforme desejado num solvente apropriado, usando a ponta da pipeta para empurrar a almofada de fundo no barril . Plug and tampa da seringa até serem necessárias. Diluições de odores frescos devem ser preparados pelo menos a cada 3 meses (ou mais freqüentemente para odores altamente voláteis e / ou muitas vezes utilizado), e as pastilhas novas devem estar preparados para seringas odor pouco antes de cada sessão de gravação. Não use esponjas de odor por mais de três estímulos, uma vez que a concentração de odor pode decair. Feito por medida olfactómetro (Figura 2): um fluxo de ar primário (1 l / min) é dirigido através de Teflon tubagem (0,4 mm de diâmetro interno); 27 cm a montante da saída deste tubo, um fluxo de ar secundário (1 l / min ) é adicionado. Ambas as correntes de ar são gerados por bombas de membrana, ea taxa de fluxo é regulada por dois fluxómetros independentes. As correntes de ar podem ser humedecido por passagem através de água em garrafas de gás de lavagem, embora deve ser tomado cuidado para evitar o excesso de humidificação-(isto é, mais do que ~ 60%). O fluxo de ar secundário é dirigido através de uma seringa de odor ou uma seringa vazia: seringas são ligados ao fluxo de ar através de uma agulha de seringa (1,2 mm de diâmetro exterior) e penetra o êmbolo. Uma válvula de três vias magnético controlado através de uma unidade de controlador de válvula (VC6 Aparelho Harvard, por exemplo) é usado para comutar entre o ar limpo e estímulo do odor. 4. Imagem in vivo Descrevemos aqui imagens usando um microscópio fluorescente na vertical (por exemplo, na vertical fixos Estágio D1 Zeiss Axio Examiner) equipada com uma objetiva de 20x de água (por exemplo Zeiss W "Plano Apochromat" 20x / 1,0 M27 DIC) (Figura 2). Para imagens com G-CAMP (excitação / emissão: 488/509 nm), use um bloco de filtro com as seguintes propriedades: 450-490 filtro de excitação nm, Dicróica espelho (T495LP) e 500-550 nm filtro de emissão (Chroma ET). Colocar o bloco de montagem contendo a mosca sob o microscópio. Posicionar a saída dos olfatômetro aproximadamente 0,5 cm à frente da antena da mosca. Abaixe o objetivo até que toque a solução de Ringer na cabeça da mosca. Olhando através do visualizador sob iluminação de campo brilhante posição, a preparação de modo que o orifício na cápsula cabeça está centrada e suas fronteiras estão em foco. Mudar para luz fluorescente e ajustar o foco até que você possa ver os neurônios marcados (aparente de fluorescência verde basal do G-CAMP). Focagem fina glomérulos de interesse através da aquisição de imagens com um dispositivo de carga acoplada (CCD) câmara (por exemplo CoolSNAP-HQ2 sistema de câmera digital) montada no microscópio usando o software de aquisição apropriado (por exemplo Metafluor) (Figura 3A). Feche o diafragma no caminho da luz de iluminação para limitar luz de excitação para a área de imagens. Para gravar odor evocadoactividade, ajustar a taxa de aquisição a 4 Hz e ajustar o tempo de exposição para obter valores de fluorescência dentro da gama dinâmica da sua câmara CCD, mas não inferior a 1000 (unidades arbitrárias), com pelo menos resolução de 12 bits dinâmico. O tempo de exposição não deve exceder 100 ms, se possível, para reduzir a G-CAMP fotobranqueamento. Se a resolução espacial da sua câmara permite, é possível aumentar o binning (número de poços no chip que será binned em um pixel digital) para reduzir o tempo de exposição. Nós obter imagens de 350×225 pixels (com um binning de 2×2), correspondentes a 210×135 iM em preparação. Essas configurações são ótimas para capturar o odor glomerulares induzidas pela respostas de G-CAMP, com resolução espacial e temporal, limitando bom repórter de branqueamento. Defina os parâmetros de medição. Nós tipicamente gravar durante 10 segundos (ou seja, 40 quadros), com a estimulação odor geralmente a partir de 4 segundos após o início do período de aquisição (quadro 15) e segundo um duradoura (uté quadro 19). Uma preparação de mosca pode normalmente ser testado com até 25-30 estímulos odor diferentes, muitas vezes limitada por uma diminuição irreversível o sinal fluorescente do repórter devido a fotodegradação. O intervalo estímulo inter-dependerá da força da resposta observada ea taxa de fotodegradação. O comprimento adequado de intervalo inter-estímulo para evitar adaptação sensorial pode ser determinada por aproximadamente apresentação repetida de um odor de controlo positivo (se conhecido) em experiências de ensaio. A inclusão deste odor a cada ~ 10 estímulos em uma dada série pode permitir a verificação da viabilidade e capacidade de resposta consistente da preparação. 5. Processamento de Dados e Análise Os dados são processados ​​usando ImageJ (com Mac biofotônica plug-in, www.macbiophotonics.ca ) e personalizadas programas escritos em Matlab e R como segue: Corrija para artefatos de movimento da amostra:alinhar todas as imagens correspondentes a uma preparação animal (por exemplo, 30 medidas de 40 frames cada) usando o "corpo rígido" modo de StackReg / TurboReg ( bigwww.epfl.ch / thevenaz / stackreg ) no ImageJ. Este passo é necessário para remover deslocamentos na posição dos neurónios marcados com respeito à armação aquisição dentro e entre as medições. No entanto, só é possível remover deslocamentos no plano xy. Os dados devem ser descartados se fortes mudanças em foco ocorrer. Segmento da pilha em medições individuais de 10 segundos (40-frame). Correta para o branqueamento de artefatos: a exposição à luz fluorescente causa fluorescência a decair durante uma única medição 10. Em alguns casos, é importante para corrigir esta decomposição antes de analisar os dados. Para cada medição calcular uma moldura de fundo. Esta deve ser a média de vários quadros antes do início do estímulo (quadros por exemplo, 6-14). Divida cada quadro por este backgarredondar moldura para obter as mudanças relativas de fluorescência. Calcular o valor médio relativo de fluorescência para cada quadro, pela média dos pixels dentro da área marcada por G-cAMP. Ajustar uma exponencial dupla para a curva média de fluorescência, dando mais forte de peso para os quadros antes do estímulo e zero peso com o tempo de resposta do odor (20 quadros após o início do estímulo, no nosso caso). Subtrair o curva ajustada a partir da curva em relação fluorescência de cada pixel. Multiplicar os quadros corrigidos pela armação de fundo para re-obter dados em bruto. Este tipo de correcção pode conduzir a uma modificação na dinâmica de resposta se o sinal não retornar à linha de base até ao final da medição (por exemplo, se inibitórios ou muito forte respostas excitatórias são evocadas) (Figura 4). Enquanto correcção de artefactos de branqueamento é útil em muitos casos, a interpretação de parâmetros temporais deve ser feita com precaução se uma correcção de lixívia é aplicado. Calcula-se a alteração relativa na fluorescência (e Delta; F / F) para cada quadro de cada medição, (F i F-0) / F 0 * 100, onde F 0 é o quadro de fundo (ver 5.3), e F i o valor de fluorescência para o quadro ª i de a medição. Calcular a média Af / F dentro de uma região circular de interesse numa glomérulo (Figura 3B) com um diâmetro de 10 pixels para obter os vestígios de actividade (Figura 5A). Se desejado, transformar estes vestígios em heatmaps usando ImageJ (Figura 5A). Calcula-se a amplitude do pico da resposta subtraindo a média Af / F de quatro quadros antes do estímulo da Af média / F de quatro quadros durante o pico da resposta. O mesmo procedimento é usado tanto para ilustrar os padrões de resposta espacial (ver Figura 3B) e para quantificar a amplitude de resposta em regiões específicas de interesse através moscas (ver Figura 5B). O pico de resposta também pode ser quantificada por integração da área abaixo da curva, durante o tempo do estímulo, ou averaginos quadros g em todo o máximo da resposta. 6. Os resultados representativos Utilizou-se os protocolos acima, para registar e analisar propiónicos respostas ácido evocados de moscas que expressam G-CaMP1.6 28 sob o controlo do promotor para o co-receptor olfativo IR8a, que é activo em várias populações diferentes de ORS 29,30 ( As Figuras 3-5). A estimulação com 1% de ácido propiónico elicia aumentos em G-cAMP fluorescência – indicando aumentos na concentração de cálcio intracelular – em que inervam ORS dois glomérulos, DC4 e DP1l (Figura 3B). Nós ilustram diferentes formas de representação de dados a partir de moscas múltiplas na Figura 5: Vestígios de linha de actividade, Heatmaps e um gráfico de barra de respostas de pico. Respostas propiónico-evocados têm amplitudes de pico distintas e dinâmicas temporais em DC4 e DP1l. Além disso, embora as respostas são geralmente robusta, a variabilidade entre animais individuais também pode ser observada em ambos os glomérulos (ver eleatmaps na Figura 5A). Quantificação das respostas de pico (Figura 5B) permite que um simples comparação estatística entre glomérulos diferentes e diferentes odores através animais. No entanto, odor evocadas respostas de cálcio pode ter não uniformes dinâmica temporal, e quantificar a sua magnitude com um único valor irá desconsiderar essa complexidade. Figura 1. Esquemático do bloco de montagem (A) antes e (B), após a introdução da mosca, e (C) vista de topo em uma estreita-se (adaptado a partir de 31). Figura 2. Esquemática do conjunto experimental. Figura 3. (A) vista de cima da preparação mosca após o passo 2,8 (painel esquerdo) e imagem de fluorescência-prima do antelóbulos NNAL rotulado com G-CaMP1.6 (genótipo: promotor IR8a: GAL4; UAS: G-CaMP1.6). DC4 e DP1l glomérulos podem ser distinguidos pela sua morfologia, tamanho e posição e estão marcadas em vermelho e azul, respectivamente. (B) da imagem com codificação de cores da resposta ao ácido propiónico (1% v / v). A imagem corresponde à Af / F do pico da resposta calculada conforme descrito na etapa 5,6 (ver também Figura 5A). O colorscale à esquerda indica o valor% Af / F. Os círculos negros indicam a posição e tamanho da região de interesse utilizado para quantificar as respostas (ver Figura 5). Figura 4. Correcção de branqueamento do sinal de repórter fluorescente. Exemplos do efeito de correcção de lixívia como descrito no passo 5,3. Os dados de exemplo no painel esquerdo pode ser corrigido sem grandes mudanças na forma da resposta. Os dados de exemplo no painel da direita é afetar gravementeed por correcção lixívia, provavelmente porque o sinal cai e é mantida abaixo de linha de base após a cessação do estímulo odor. A Figura 5 (A) superior:. Dinâmica temporal de respostas de cálcio de glomérulos DC4 (esquerda) e DP1l (direita) para o ácido propiónico (1% v / v). Os traços negros mostram a mediana da Af média / F na região de interesse (ver Figura 3B) em oito animais. A superfície cinza indica o intervalo entre os primeiro e terceiro quartil da distribuição. Apresentação dos valores medianos e quartis fornece mais informações sobre a variabilidade e distribuição de respostas observadas de média e erro padrão. As caixas de verde e magenta indicam os quadros para calcular a média das respostas máximas mostrados na Figura 3B, e quantificado na Figura 5B. Conclusão: os heatmaps mostrar os dados de resposta para todos os animais individuais em linhas separadas, com Af / F valores represented pelo colorscale (extrema direita). As barras horizontais pretas indicam o tempo ea duração do estímulo. (B) A mediana respostas de pico para ácido propiônico em oito animais para DC4 e glomérulos DP1l. As barras de erro indicam o intervalo entre primeiro e terceiro quartil da distribuição.