التصوير الكالسيوم من الردود، رائحة أثار في ذبابة الفاكهة لوب Antennal
Summary
وصفنا تقنية أنشئت لقياس وتحليل رائحة استجابات الكالسيوم في الفص antennal المعيشة<em> ذبابة الفاكهة السوداء البطن</em>.
Abstract
الفص antennal هو المركز الرئيسي الشم في المخ الحشرات، وتمثل ما يعادل التشريحية والوظيفية لمبة وشمي الفقاريات 1-5. تبث معلومات حاسة الشم في العالم الخارجي من اجل الفص antennal بواسطة الخلايا العصبية الحسية الشمية (OSNs)، والذي فصل في مناطق مختلفة من neuropil تسمى كبيبات وفقا لمستقبلات حاسة الشم الخاصة التي تعبر عنها. هنا، يمكن نظام التشبيك المفتوح المحاور المشبك مع كل من interneurons المحلي (LNS)، الذي يعصب الكبيبات عمليات مختلفة وكثيرة، والخلايا العصبية الإسقاط (السندات الإذنية)، والتي تنقل المعلومات الشمية إلى أعلى مناطق الدماغ حاسة الشم.
بصري التصوير لنشاط LNS، OSNs والسندات الإذنية في الفص antennal – باستخدام المؤشرات الكالسيوم تقليديا الاصطناعية (مثل الأخضر الكالسيوم، FURA-2) أو الجهد حساسة الأصباغ (مثل RH414) – منذ فترة طويلة وهي تقنية مهمة لفهم كيفية حاسة الشم وتتمثل الحوافز والأنماط المكانية والزمانيةالنشاط الكبيبي في العديد من أنواع الحشرات 6-10. تطوير وراثيا ترميز للصحفيين النشاط العصبي، مثل مؤشرات الكالسيوم فلوري G-كامب 11،12 و Cameleon 13، ومؤشر الكالسيوم bioluminescent GFP-aequorin 14،15، أو مراسلا لانتقال متشابك، جعلت synapto-pHluorin ال 16 نظام حاسة الشم لذبابة الفاكهة، ذبابة الفاكهة السوداء البطن، يمكن الوصول إليها بشكل خاص للتصوير العصبي، وتكملة لها على نحو شامل، ووصف الخصائص الجزيئية، والكهربية وتشريحي عصبي 2،4،17. ويمكن للصحفيين وأعرب هؤلاء عن طريق انتقائي ثنائي أنظمة التحكم النسخي (على سبيل المثال GAL4/UAS 18، به lexa / LexAop 19،20، نظام س 21) في تعريف السكان من الخلايا العصبية داخل الدوائر حاسة الشم لتشريح مع ارتفاع القرار المكانية والزمانية كيف رائحة أثار ويمثل النشاط العصبي، والتضمين، وتحولت 22-24 </ سوب>.
نحن هنا وصف الطرق إعداد وتحليل لقياس رائحة استجابات في الفص ذبابة الفاكهة antennal باستخدام G-كامب 25-27. إعداد الحيوان مينيملي ويمكن تكييفها لالتصوير باستخدام نطاق ومجال المجاهر مضان، مبائر واثنين من الفوتون.
Protocol
1. تصاعد بلوك الجمعية وينبغي بذل كتلة شبكي التركيب (الشكل 1A) للمواصفات الدقيقة التي وردت في مخطط (متوفر من http://neuro.uni-konstanz.de/j ove_mountingblock_blueprint / ) للسماح للتركيب سهل وتشريح الذبابه. الموضوع عن طريق مسامير من الخلف ولكن لا مدها إلى ما بعد الجزء الأمامي من كتلة، وسيتم تعديل وضعها خلال التحضير للحيوان (انظر 2.7). باستخدام الحفر الدقة، إحداث تأثير في الحد العلوي للغرفة دائرية لذبابة، وحفر تحت السطح لافساح المجال لجسد الذبابة، والحد من سماكة للكتلة عند هذه النقطة. قطع شبكة النحاس مع عمودي مشرط وعلى مقربة من الجزء السفلي من فتحة لخلق "طوق". تأكد اثنان اللوحات الناتجة مستوى، وهذا سيساعد على إدخال الطيران. مع المسواك، ضع قطرة صغيرة من superglue على كتلة تصاعد فوق غرفة دائرية لحظر الطيران. وضع شبكة من النحاس على الغراء وموقفها بحيث يتركز الشق على الكتلة (الشكل 1A). اضغط لأسفل بلطف وإزالة أي فائض الغراء. مع زوج من ملاقط، إضافة قطرات صغيرة من الغراء تحت اللوحات على كل جانب وأضعاف الشبكة أكثر من الجزء الأمامي من كتلة بحيث يتم شق لافتا إلى أسفل على التوالي. تأكد من الجزء العلوي من الشبكة هو مستوى مع الكتلة. السماح ليجف تماما. تجميع حامل الأسلاك: قطع من البلاستيك في النصف ساترة وإزالة قطعة المركزية لتقديم "يو" شكل. استخدام شمع العسل إلى الغراء قطعة من الأسلاك عبر الجزء العلوي من "U"، لا تجعل سلك مشدود جدا. بناء درع antennal: إحداث ثقب في ساترة البلاستيكية التي تحتوي على ورقة ثقب كمة. تقليم حواف ساترة إلى 0.5 سم 0.7 X. الغراء في ساترة مثقوب من البلاستيك لشريط لاصق، ثم وضع قطرة من الايثانول على الشريط يتعرض من خلال ثقب فيإزالة لاصق. 2. حيوان التحضير الذباب من النمط الجيني المناسبة – أي التي تحمل تركيبة المطلوب من "سائق" والجينات المحورة النشاط الصحفي – يجب أن تكون 1-3 أسابيع من العمر، وإهاب من الذباب الأصغر سنا لينة جدا وصعبة لخفض. عندما تتطلب التجارب المقارنة المباشرة من التراكيب الوراثية المختلفة، ولكي تتطابق مع مستويات التعبير التحوير، وينبغي أن يكون سن الذباب المطابقة لتجنب الخلافات المتعلقة بتقدم العمر الفيزيولوجي. إذا بين الجنسين ليست مهمة، ونحن نفضل استخدام الذباب الإناث منذ لديهم أكبر رؤساء وأسهل للتلاعب. تخدير الذباب عن طريق التبريد على الجليد. أعرض ذبابة واحدة إلى كتلة متزايدة. الاستمرار على الطاير من قبل جناح مشترك، والانزلاق، الظهرية سطح الأولى، على طول الشق من الشبكة النحاسية بحيث يتم تعليقها بواسطة رقبتها (الشكل 1B-C). إذا لزم الأمر، وتناوب عليه حتى يتم النظر إلى أسفل. وضع العمود الفقري صبار غرامة أمام ولاي ورئيس لمنعه من الهرب (الشكل 1B-C). وضع العمود الفقري صبار أمام خرطوم لمنعه من التحرك. إصلاح العمود الفقري صبار إلى كتلة باستخدام شمع العسل. تأكد من أن الجزء العلوي من الرأس مع مستوى أعلى من الكتلة. حل رئيس يطير إلى كتلة مع قطرة صغيرة من الصنوبري (الذائبة في الايثانول). وضع كتلة في مربع مرطب والسماح للروزبن لتتصلب لمدة ساعة واحدة تقريبا. باستخدام ملقط، سحب لوحة antennal إلى الأمام وإسقاط الأسلاك على حامل (الشمع الجانب خارج، وانظر 1.5) في حظيرة جليدية بين الهوائي والرأس. إصلاح حائز على الجزء الأمامي من كتلة مع شمع العسل. باستخدام مسامير صلب كتلة، دفع بلطف حامل الأسلاك إلى الأمام لخلق بعض المسافة بين لوحة antennal والرأس. وضع درع antennal (انظر 1.6) على الجزء العلوي من رأس الذبابة مع ثقب في وضع مركزيا. إصلاح مع شمع العسل إلى الجزء العلوي من كتلة متزايدة. باستخدام شفرة، الخائن، مكعبتا ثقب صغير في الشريط على درع تعريض بشرة من رأس الذبابة وراء الهوائي. وينبغي أن الثقب لا تتجاوز العينين لمنع تسرب من إعداد. اغلاق الفتحة بين الشريط وإهاب ومع اثنين من عنصر السيليكون. إزالة أي فائض السيليكون من أعلى رأس الذبابة. ضع قطرة من ذبابة الفاكهة رينغر ملحي (كلوريد الصوديوم 130 ملم، 5 ملم بوكل، 2 مم MgCl 2، 2 مم CaCl 2، 36 ملم السكاروز، 5 HEPES مم، درجة الحموضة 7.3) على رأسه. تأكد من عدم وجود تسربات: والهوائيات يجب أن تظل جافة تماما. باستخدام شفرة الياقوت، وقطع ثقب في إهاب. أولا، بخفة درجة على طول حظيرة جليدية مباشرة وراء الهوائي، ثم قص على طول عيون وعبر التي تشبه على ظهره. أخيرا، طي قطعة من إهاب على الحافة وسجل وقطع من الجانب السفلي لتجنب قطع الأعصاب antennal. إزالة الغدد بعناية والقصبة الهوائية مع ملاقط غرامة. شطف مرارا مع ذبابة الفاكهة </EM> رينغر، مما أسفر عن انخفاض كبير في رأسه. 3. رائحة المحفز التسليم الحقن رائحة: اضافة الى وجود وسادة السليلوز إلى حقنة من البلاستيك 2 مل مع ملقط نظيفة وماصة على ذلك (باستخدام نصائح فلتر) 20 ميكرولتر من رائحة، مخففة كما هو مطلوب في مذيب مناسب، وذلك باستخدام معلومات سرية ماصة لدفع وسادة في عمق برميل . المكونات وغطاء المحقنة حتى المطلوبة. وينبغي إعداد التخفيفات رائحة جديدة على الأقل كل 3 أشهر (أو أكثر في كثير من الأحيان عن الروائح شديدة التقلب و / أو استخدامها في كثير من الأحيان)، كما ينبغي إعداد منصات جديدة للمحاقن رائحة قبل كل جلسة تسجيل. لا تستخدم منصات رائحة لأكثر من ثلاثة التحفيز، حيث أن تركيز رائحة قد الاضمحلال. يتم توجيه تيار الهواء الأساسي (1 لتر / دقيقة) من خلال أنابيب من التفلون (0.4 مم القطر الداخلي)؛ 27 سم المنبع للخروج من هذا الأنبوب، وتيار الهواء الثانوي (1 لتر / دقيقة: حسب الطلب olfactometer (الشكل 2) ) يضاف. يتم إنشاء كل من تيارات الهواء بواسطة مضخات غشاء، ووينظم معدل التدفق من قبل اثنين من تدفق مستقل. لا يمكن للتيارات الهواء يكون مرطب بعبورها الماء في قوارير الغاز الغسيل، وعلى الرغم من ضرورة الحرص على تجنب الإفراط في ترطيب (أي أكثر من 60٪ ~). يتم توجيه تيار الهواء الثانوي إما عن طريق حقنة رائحة أو حقنة فارغة: يتم توصيل الحقن لتدفق الهواء من خلال إبرة حقنة (1.2 مم القطر الخارجي) اختراق الغطاس. ويستخدم صمام ثلاثي المغناطيسي التحكم فيها عن طريق صمام وحدة تحكم (على سبيل المثال جهاز VC6 هارفارد) للتبديل بين الهواء النقي والتحفيز رائحة. 4. في الجسم الحي التصوير نحن هنا وصف التصوير باستخدام مجهر تستقيم فلوري (على سبيل المثال ثابتة تستقيم المرحلة زييس محوري D1 ممتحن) مجهزة موضوعي المياه 20X (مثل زايس W "خطة، لامزيغ" 20X / 1،0 M27 مدينة دبي للإنترنت) (الشكل 2). للتصوير مع G-المخيم (إثارة / الانبعاثات: 488/509 نانومتر)، واستخدام كتلة فلتر مع الخصائص التالية: 450-490 مرشح إثارة نانومتر، مزدوج اللون مرآة (T495LP) و 500-550 نانومتر انبعاث فلتر (كروما ET). وضع حجر المتصاعدة التي تحتوي على ذبابة تحت المجهر. وضع الخروج من الطول حوالي 0.5 olfactometer أمام الهوائيات الذبابة. خفض الهدف حتى أنها تمس الحل رينغر على رأس ذبابة. يبحث من خلال المشاهد تحت مشرق مجال الإضاءة، وموقف لإعداد بحيث يتم توسيط ثقب في كبسولة الرأس وحدودها هي في التركيز. التحول إلى ضوء الفلورسنت وضبط التركيز حتى تتمكن من رؤية الخلايا العصبية المسماة (واضح من مضان أخضر القاعدية من G-كامب). تركيز جيد على الكبيبات من اهتمام من خلال الحصول على الصور مع جهاز المسؤول الديناميكي (CCD) كاميرا (مثل كاميرا رقمية CoolSNAP-HQ2 النظام) التي شنت على مجهر باستخدام البرمجيات المناسبة اكتساب (على سبيل المثال Metafluor) (الشكل 3A). إغلاق الحاجز في إنارة الطريق للحد من ضوء ضوء إثارة في المنطقة المصورة. لتسجيل رائحة أثارالنشاط، تحديد سعر الاستحواذ إلى 4 هرتز وضبط وقت التعرض للحصول على القيم مضان ضمن مجموعة ديناميكية من كاميرا CCD الخاص بك، ولكن ليس أقل من 1000 (وحدات التعسفي)، مع القرار 12 بت على الأقل ديناميكية وينبغي في الوقت التعرض لا يتجاوز 100 مللي ثانية، إذا كان ذلك ممكنا، للحد من G-كامب photobleaching. إذا كان القرار المكانية من الكاميرا يسمح، يمكنك زيادة binning (عدد من الآبار على الشريحة التي سيتم اهمال في بكسل واحد الرقمية) للحد من التعرض الوقت. نحن الحصول على صور من 350×225 بكسل (مع وجود binning من 2X2)، الموافق 210×135 ميكرومتر في إعداد. هذه الإعدادات هي الأمثل لالتقاط رائحة الكبيبي الناجم عن ردود مخيم-G مع قرار جيد المكانية والزمانية في الوقت الذي تحد مراسل التبييض. تعيين المعلمات قياس. نسجل عادة لمدة 10 ثانية (أي 40 إطارات)، مع التنبيه رائحة انطلاق عادة 4 ثوان بعد بداية فترة اكتساب (اف 15) ودائم ثانية واحدة (شntil إطار 19). يمكن عادة لإعداد ذبابة يتم اختبارها مع ما يصل الى 25-30 المحفزات رائحة مختلفة، وغالبا ما تكون محدودة من قبل الانخفاض لا رجعة فيه في إشارة فلوري لمراسل بسبب photobleaching. والفاصل الزمني بين التحفيز تعتمد على قوة استجابة لاحظ ومعدل photobleaching. ويمكن تحديد الطول المناسب لفترة ما بين التحفيز لتجنب التكيف الحسي من قبل ما يقرب من العرض المتكرر لرائحة السيطرة الايجابية (إذا كانت معروفة) في التجارب محاكمة. إدراج هذه الرائحة يمكن كل ~ 10 منبهات في سلسلة معينة تسمح بالتحقق من استمرار البقاء والقدرة على الاستجابة الثابت للإعداد. 5. معالجة البيانات وتحليلها تتم معالجة البيانات باستخدام يماغيج (مع ماك بيوفوتونيك في المكونات، www.macbiophotonics.ca ) والعرف البرامج المكتوبة في Matlab والبحث على النحو التالي: تصحيح للحركة الفنية عينة:محاذاة جميع الصور المقابلة لإعداد حيوان واحد (على سبيل المثال 30 القياسات من 40 لقطة من كل منهما) باستخدام "جامدة الجسم" واسطة من StackReg / TurboReg ( bigwww.epfl.ch / thevenaz / stackreg ) في يماغيج. هذه الخطوة مطلوبة لإزالة تحولات في الموقف من الخلايا العصبية المسماة فيما يتعلق إطار اكتساب داخل وبين القياسات. ومع ذلك، فمن الممكن الوحيد لإزالة التحولات في طائرة س ص. يجب التخلص من البيانات إذا تغييرات قوية في التركيز تحدث. قطعة مكدس إلى فرد قياسات 10 في الثانية (40 إطارا). الصحيح لتبييض التحف: سوف التعرض لضوء الفلورسنت تسبب مضان للتسوس خلال قياس واحدة 10. في بعض الحالات، من المهم لتصحيح هذا الاضمحلال قبل تحليل البيانات. لكل حساب قياس إطار الخلفية. ينبغي أن يكون هذا الوسط من قبل العديد من الأطر بداية التحفيز (إطارات على سبيل المثال 6-14). تقسيم كل إطار من هذه backgجولة إطار للحصول على التغيرات النسبية مضان. حساب متوسط قيمة مضان النسبية لكل إطار عن طريق حساب متوسط كل خلية داخل المنطقة وصفت من قبل G-المخيم. تناسب الأسي المزدوج إلى المنحنى مضان المتوسط، مع إعطاء وزن أكبر للإطارات قبل التحفيز والوزن صفر إلى وقت استجابة رائحة (20 لقطة بعد ظهور حافز في حالتنا). طرح منحنى المجهزة من المنحنى مضان النسبية لكل بكسل. مضاعفة الإطارات تصحيح الإطار خلفية لإعادة الحصول على البيانات الخام. قد يكون هذا النوع من التصحيح يؤدي الى تعديل في ديناميات استجابة إذا كان إشارة لا يرجع إلى خط الأساس بحلول نهاية القياس (على سبيل المثال إذا ما استدعى ردود مثير المثبطة أو قوية جدا) (الشكل 4). في حين تصحيح من التحف التبييض هو مفيد في كثير من الحالات، ينبغي تفسير المعلمات الزمنية بحذر إذا تم تطبيق التصحيح التبييض. حساب التغير النسبي في مضان (& ديLTA، F / F) لكل إطار من كل قياس مثل (F-F أنا 0) / 0 * F 100، حيث F 0 هو إطار خلفية (انظر 5.3)، وواو أنا قيمة مضان للإطار ال الأول من القياس. حساب متوسط ΔF / F داخل منطقة دائرية من مصلحة في الكبيبة (الشكل 3B) التي يبلغ قطرها 10 بكسل للحصول على آثار النشاط (الشكل 5A). اذا شئت، وتحويل هذه الآثار إلى heatmaps باستخدام يماغيج (الشكل 5A). حساب السعة القصوى للاستجابة من خلال طرح ΔF متوسط / F من أربعة إطارات قبل التحفيز من ΔF متوسط / F من أربعة إطارات في ذروة الاستجابة. يتم استخدام نفس الإجراء على حد سواء لتوضيح أنماط استجابة المكاني (انظر الشكل 3B)، وإلى قياس مدى استجابة في مناطق معينة من اهتمام عبر الذباب (انظر الشكل 5B). ويمكن أيضا للاستجابة الذروة يكون كميا، من خلال دمج منطقة تحت منحنى خلال ذلك الوقت من التحفيز، أو averaginز الأطر حول الحد الأقصى للاستجابة. 6. ممثل النتائج كنا البروتوكولات المذكورة أعلاه لتسجيل وتحليل للحمض البروبيونيك ردود أثار الذباب معربا عن G-28 CaMP1.6 تحت سيطرة المروج للIR8a شارك في مستقبلات الشم، التي تنشط في مختلف قطاعات السكان من عدة OSNs 29،30 ( الأرقام 3-5). التحفيز مع حامض البروبيونيك 1٪ مثير للزيادات في G-كامب مضان – تشير إلى زيادة في الكالسيوم بين الخلايا – في OSNs التعصيب 2 الكبيبات، DC4 وDP1l (الشكل 3B). نحن توضيح الطرق المختلفة للتمثيل البيانات من الذباب متعددة في الشكل 5: آثار النشاط خط، heatmaps ومؤامرة شريط من ردود الذروة. ردود البروبيونيك حمض أثار لديها سعة قمة متميزة وديناميكية الزمنية في DC4 وDP1l. وعلاوة على ذلك، على الرغم من ردود عادة ما تكون قوية، ويمكن أيضا التباين بين الحيوانات الفردية يتعين مراعاتها في كل من الكبيبات (انظر انهatmaps في الشكل 5A). الكمي للردود الذروة (الشكل 5B) يسمح بمقارنة بسيطة بين الكبيبات الإحصائية المختلفة وodorants مختلفة عبر الحيوانات. ومع ذلك، يمكن أن رائحة استجابات الكالسيوم يكون غير موحدة ديناميات الزمانية، وقياس حجمها مع قيمة واحدة وتجاهل هذا التعقيد. الشكل 1. تخطيطي من كتلة التجمع (A) قبل وبعد (ب) مقدمة من الطاير، و (ج) وجهة نظر في أعلى من مسافة قريبة (مقتبس من 31). الشكل 2. تخطيطي لتجريبية تصل ضبط. الشكل 3: (أ) رأي كبار من إعداد الذبابة بعد خطوة 2.8 (لوحة على اليسار) وصورة مضان الخام من ما كان عليه سابقافصوص nnal المسمى مع G-CaMP1.6 (الوراثي: IR8a المروج: GAL4؛ UAS: G-CaMP1.6). ويمكن تمييز DC4 والكبيبات DP1l من حجمها، والصرف والموقف ويتم وضع علامة في الأحمر والأزرق، على التوالي. (ب) اللون تلوينها صورة من الرد على حامض البروبيونيك (1٪ V / V). صورة يتوافق مع ΔF / F من ذروة استجابة محسوبة كما هو موضح في الخطوة 5.6 (انظر أيضا الشكل 5A). وcolorscale على اليسار يشير إلى٪ ΔF / F قيمة. الدوائر السوداء تشير إلى موقف وحجم المنطقة التي تهم المستخدم لقياس ردود الفعل (انظر الشكل 5). الشكل 4. تصحيح تبيض للإشارة مراسل فلوري. أمثلة على تأثير تصحيح التبييض كما هو موضح في الخطوة 5.3. يمكن تصحيح البيانات النموذجية في اللوحة اليسرى من دون تغييرات كبيرة في شكل استجابة. نموذج البيانات على لوحة الحق وتؤثر بشدةبقلم تصحيح التبييض، على الأرجح، لأن قطرات إشارة ويتم الاحتفاظ تحت خط الأساس بعد انتهاء التحفيز رائحة. الشكل 5 (A) الأعلى: ديناميات الزماني للاستجابات الكالسيوم من الكبيبات DC4 (يسار) وDP1l (يمين) إلى حمض البروبيونيك (1٪ V / V). آثار سوداء تظهر وسيطة من ΔF متوسط / F داخل المنطقة من اهتمام (انظر الشكل 3B) في ثماني الحيوانات. على سطح رمادي يشير إلى مدى بين quartiles الأول والثالث للتوزيع. عرض متوسط القيم والربع توفر المزيد من المعلومات حول التغير وتوزيع ردود المرصودة من الخطأ المتوسط ومعيار. المربعات الخضراء وأرجواني تشير الأطر المتوسط لحساب ردود الذروة هو مبين في الشكل 3B، وكميا في الشكل 5B. أسفل: وheatmaps تظهر البيانات استجابة لجميع الحيوانات الفردية في صفوف منفصلة، مع ΔF / F القيم represented من colorscale (أقصى اليمين). وقضبان أفقية سوداء تشير إلى وقت ومدة التحفيز. (ب) ردود ذروة متوسط لحامض البروبيونيك في ثماني الحيوانات لDC4 والكبيبات DP1l. أشرطة الخطأ تشير تتراوح ما بين quartiles الأول والثالث للتوزيع.
Discussion
ويمكن استخدام أساليب إعداد وتحليل وصفها هنا لتحليل رائحة استجابات في أية مجموعة من السكان من الخلايا العصبية في الفص antennal (OSNs، LN والسندات الإذنية) التي يكون التحوير سائق المطابق هو متاح. في حين وصفنا تطبيقه باستخدام مجهر مضان يمكن، على قدم المساواة التصوير الضوئي من هذا الإعداد يتم تنفيذها باستخدام متحد البؤر المجهري أو اثنين من الفوتون، 22،32. في الواقع، وهذه الصكوك الأخيرة التخفيف من مشكلة ضوء تشتت واسع المجال المجهري، والتي يمكن أن تقلل من قرار من الصور، وخصوصا عندما أعداد كبيرة من الخلايا العصبية صريحة الصحفي. هذا الإعداد يسمح عادة تسجيلات لاستجابات رائحة أثار لمدة ساعة على الأقل نصف السنة، ولكن هذه المرة يمكن أن تكون أطول بكثير أو أقل اعتمادا على عدد وطول القياسات سجلت، في الوقت التعرض المستخدمة في كل لقطة والفاصل الزمني بين التحفيز. وعلاوة على ذلك، يمكن للثنائي الفوتون إثارة خفض photobleaching من مندوب فلوريorter، فضلا عن الضيائية الخلوية، للسماح لقياس مدى فترات زمنية أطول 22،32.
بغض النظر عن اختيار المجهر، الحركة من الدماغ ذبابة داخل كبسولة الرأس من أكثر المشاكل المتكررة عند التصوير في حيوانات سليمة. في حين تصحيح حركة يمكن تصحيح القضايا البسيطة (الخطوة 5.1)، وهي عادة ما تكون أفضل فقط لتسجيل من الاستعدادات درجة عالية من الاستقرار. استراتيجيات للحد من الآثار حركة ما يلي: (ط) يقيد بشكل صحيح خرطوم الفيل من الذبابة مع العمود الفقري صبار، (الثاني) شل حركة الساقين الذبابة عن طريق تحديد لهم على خشبة المسرح مع eicosane (قبل الخطوة 2.6) (يمكن ذاب eicosane في ~ 37 درجة مئوية، واستخدام سلك من الفضة لتوسيع وصقل غيض من حديد لحام لهذا الغرض)، (الثالث) الخدش المريء (وضوحا بين الأعصاب antennal) مع ملاقط غرامة.
بالإضافة إلى G-CaMP1.6 المستخدمة هنا، وعدد من إصدارات محسنة من G-المخيم والكالسيوم مؤشرات أخرى متاحة،والتي تختلف في نسبة إشارة إلى الضجيج بهم، مضان خط الأساس وديناميات الزمنية 12،28،33. وينبغي اختيار دقيق للاستشعار تأخذ في الاعتبار كل من هذه الخصائص، ليتم تحليلها في نوع من الخلايا العصبية، ويجري تناول هذه المسألة البيولوجية. أجهزة الاستشعار الحالية عن التغييرات الكالسيوم التي ترتبط بشكل جيد مع إمكانات عمل 12،34، وتحسينها، إلى جانب الأعداد المتزايدة من خطوط محددة سائق الجينية 35 ستواصل تعزيز إمكانات التصوير الضوئي من النشاط العصبي في الذبابة سليمة.
Disclosures
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
نحن نعترف سيلكه Sachse وEisermann بيات في تطوير هذه المنهجية، بابلو Traversa لرسم المخططات كتلة متزايدة وPelz دانييلا لاستخدام التخطيطي في الشكل 1. ونحن ممتنون لSachse سيلكه، Ramdya بافان ورافاييل Rytz للتعليق على المخطوطة. ويدعم ر الجرس قبل بورنغير إنغلهايم دكتوراه زمالة مؤسسة. ويتم تمويل البحوث في مختبر ر بنتون في العام من قبل مجلس البحوث الأوروبي ابتداء المستقلة جرانت الباحث السويسري والمؤسسة الوطنية للعلوم.
Materials
| Reagent | Supplier | Catalogue number | Comments |
| Cactus spine | Garden center | ~7mm long thin, not too flexible | |
| Rosin | String instrument shop | ||
| Two component silicon | WPI | KWIK-SIL | |
| Custom made plexiglass mounting block | Blueprints available from http://neuro.uni-konstanz.de/jove_mountingblock_blueprint/ |
||
| Copper grids | Athene Grids | G220-5 | Normally used for electron microscopy samples. |
| Screws | Hardware store | 2 mm diameter | |
| Plastic coverslips | Plano-em | L4193 | 22 X 22 mm |
| Soldering iron tips | Conrad Electronics | 830283-62 | |
| Regulated power supply | Conrad Electronics | 511407-62 | |
| Thin wire | Isabellenhütte | Isa-ohm | 0.013 mm |
| Eicosane | Sigma | 21,927-4 | |
| Microscope | Zeiss | Axioexaminer D1 | |
| CCD camera | Visitron | CoolSnap HQ | |
| Metafluor | Visitron | Acquisition software | |
| Monochromator | Visitron | Visichrome | |
| Breakable blades | Fine Science Tools | 10050-00 | |
| Holder for blade | WPI | 14134 | |
| Sapphire blade | WPI | 500314 | Double edged blade 1mm |
| Membrane gas pumps | KNF Neuberger AG | NMP 830 KVE | |
| Sapphire blade holder | WPI | 500317 | |
| Three way valve | Lee Company | LFAA1200118H | Configuration E |
| Rotameter 500 ml/min | Analyt-MTC | 112-08SA | |
| Rotameter 5 L/min | Analyt-MTC | 102-08SA | |
| Beeswax | Siladent Technik | 209212 | |
| Cellulose pad | Kettenbach Medical | 31003 | |
| Tweezers | Plano-em | T5130 | Dumont biology #5 |
| Syringes | BD | 300928 | 2ml, Discardit II, 2pieces |
| Needles | Braun Sterican | 4665120 | 1.2mm OD |
References
- Galizia, C. G., Rossler, W. Parallel olfactory systems in insects: anatomy and function. Annu. Rev. Entomol. 55, 399-420 (2010).
- Vosshall, L. B., Stocker, R. F. Molecular Architecture of Smell and Taste in Drosophila. Annu. Rev. Neurosci. 30, 505-533 (2007).
- Wilson, R. I., Mainen, Z. F. Early events in olfactory processing. Annu. Rev. Neurosci. 29, 163-201 (2006).
- Masse, N. Y., Turner, G. C., Jefferis, G. S. Olfactory information processing in Drosophila. Curr. Biol. 19, 700-713 (2009).
- Hansson, B. S., Anton, S. Function and morphology of the antennal lobe: new developments. Annu. Rev. Entomol. 45, 203-231 (2000).
- Galizia, C. G., Joerges, J., Kuttner, A., Faber, T., Menzel, R. A semi-in-vivo preparation for optical recording of the insect brain. J. Neurosci. Methods. 76, 61-69 (1997).
- Galizia, C. G., Menzel, R., Holldobler, B. Optical imaging of odor-evoked glomerular activity patterns in the antennal lobes of the ant Camponotus rufipes. Naturwissenschaften. 86, 533-537 (1999).
- Okada, K., Kanzaki, R., Kawachi, K. High-speed voltage-sensitive dye imaging of an in vivo insect brain. Neurosci. Lett. 209, 197-200 (1996).
- Carlsson, M. A., Knusel, P., Verschure, P. F., Hansson, B. S. Spatio-temporal Ca2+ dynamics of moth olfactory projection neurones. The European journal of neuroscience. 22, 647-657 (2005).
- Galizia, C. G., Vetter, R. S., Christensen, T. A. . Methods in Insect Sensory Neuroscience (Frontiers in Neuroscience). 13, 349-392 (2005).
- Nakai, J., Ohkura, M., Imoto, K. A high signal-to-noise Ca(2+) probe composed of a single green fluorescent protein. Nat. Biotechnol. 19, 137-141 (2001).
- Tian, L. Imaging neural activity in worms, flies and mice with improved GCaMP calcium indicators. Nat. Methods. 6, 875-881 (2009).
- Miyawaki, A., Griesbeck, O., Heim, R., Tsien, R. Y. Dynamic and quantitative Ca2+ measurements using improved cameleons. Proc. Natl. Acad. Sci. U.S.A. 96, 2135-2140 (1999).
- Martin, J. R., Rogers, K. L., Chagneau, C., Brulet, P. In vivo bioluminescence imaging of Ca signalling in the brain of Drosophila. PLoS One. 2, 275-275 (2007).
- Murmu, M. S., Stinnakre, J., Martin, J. R. Presynaptic Ca2+ stores contribute to odor-induced responses in Drosophila olfactory receptor neurons. The Journal of Experimental Biology. 213, 4163-4173 (2010).
- Yuste, R., Miller, R. B., Holthoff, K., Zhang, S., Miesenbock, G. Synapto-pHluorins: chimeras between pH-sensitive mutants of green fluorescent protein and synaptic vesicle membrane proteins as reporters of neurotransmitter release. Methods Enzymol. 327, 522-546 (2000).
- Benton, R. Sensitivity and specificity in Drosophila pheromone perception. Trends Neurosci. 30, 512-519 (2007).
- Elliott, D. A., Brand, A. H. The GAL4 system : a versatile system for the expression of genes. Methods Mol. Biol. 420, 79-95 (2008).
- Lai, S. L., Lee, T. Genetic mosaic with dual binary transcriptional systems in Drosophila. Nat. Neurosci. 9, 703-709 (2006).
- Yagi, R., Mayer, F., Basler, K. Refined LexA transactivators and their use in combination with the Drosophila Gal4 system. Proc. Natl. Acad. Sci. U.S.A. 107, 16166-16171 (2010).
- Potter, C. J., Tasic, B., Russler, E. V., Liang, L., Luo, L. The Q System: A Repressible Binary System for Transgene Expression, Lineage Tracing, and Mosaic Analysis. Cell. 141, 536-548 (2010).
- Wang, J. W., Wong, A. M., Flores, J., Vosshall, L. B., Axel, R. Two-photon calcium imaging reveals an odor-evoked map of activity in the fly brain. Cell. 112, 271-282 (2003).
- Fiala, A. Genetically expressed cameleon in Drosophila melanogaster is used to visualize olfactory information in projection neurons. Curr. Biol. 12, 1877-1884 (2002).
- Ng, M. Transmission of olfactory information between three populations of neurons in the antennal lobe of the fly. Neuron. 36, 463-474 (2002).
- Sachse, S. Activity-dependent plasticity in an olfactory circuit. Neuron. 56, 838-850 (2007).
- Pelz, D., Roeske, T., Syed, Z., de Bruyne, M., Galizia, C. G. The molecular receptive range of an olfactory receptor in vivo (Drosophila melanogaster Or22a). J. Neurobiol. 66, 1544-1563 (2006).
- Silbering, A. F., Galizia, C. G. Processing of odor mixtures in the Drosophila antennal lobe reveals both global inhibition and glomerulus-specific interactions. J. Neurosci. 27, 11966-11977 (2007).
- Reiff, D. F. In vivo performance of genetically encoded indicators of neural activity in flies. J. Neurosci. 25, 4766-4778 (2005).
- Abuin, L. Functional architecture of olfactory ionotropic glutamate receptors. Neuron. 69, 44-60 (2011).
- Benton, R., Vannice, K. S., Gomez-Diaz, C., Vosshall, L. B. Variant ionotropic glutamate receptors as chemosensory receptors in Drosophila. Cell. 136, 149-162 (2009).
- Pelz, D. . Functional characterization of Drosophila melanogaster Olfactory Receptor Neurons. , (2005).
- Ai, M. Acid sensing by the Drosophila olfactory system. Nature. 468, 691-695 (2010).
- Martin, J. R. In Vivo Brain Imaging: Fluorescence or Bioluminescence, Which to Choose?. Journal of Neurogenetics. , 1-23 (2008).
- Jayaraman, V., Laurent, G. Evaluating a genetically encoded optical sensor of neural activity using electrophysiology in intact adult fruit flies. Front. Neural Circuits. 1, 3-3 (2007).
- Pfeiffer, B. D. Tools for neuroanatomy and neurogenetics in Drosophila. Proc. Natl. Acad. Sci. U.S.A. 105, 9715-9720 (2008).
Cite This Article
Silbering, A. F., Bell, R., Galizia, C. G., Benton, R. Calcium Imaging of Odor-evoked Responses in the Drosophila Antennal Lobe. J. Vis. Exp. (61), e2976, doi:10.3791/2976 (2012).