Fluoreszierende Nanopartikel für die Messung von Ionen-Konzentration in biologischen Systemen

1. Vorbereitung der Optode Vor der Optode werden Aliquots der Komponenten müssen so dass sie leicht gemessen und gespeichert werden. A 50 mg Natrium-Ionophor X (Naix) Fläschchen und eine 50 mg Natrium-Tetrakis [3,5-Bis (trifluormethyl) phenyl] borat (NaTFPB) wird jeweils bis in tetrahyrdofuran (THF) gebracht werden und aliquotiert in 1,5 ml Polystyrol Röhrchen. In einem Laborabzug lösen sich die 50 mg Naix in 1 ml THF in der Schifffahrt Fläschchen und mischen, um sicherzustellen, dass der Feststoff vollständig gelöst. Transfer 100 ul dieser Lösung in 10 separaten Zentrifugenröhrchen. Wiederholen Sie dies für NaTFPB. Lassen Sie das THF in einem Laborabzug über Nacht verdunsten, beschriften Sie die Röhrchen und legen Sie sie in einem 4-Grad-Kühlschrank für die Aufbewahrung. Dies schafft 5 mg Aliquots trocken Naix und NaTFPB. Lösen Sie die Chromoionophor III (CHIII) in 1 ml THF und in ein 3 ml Glasflasche. Add another 1 ml THF zu der CHIII Versand Fläschchen, um restliche CHIII auflösen und addieren sie zum 3 ml Glasflasche. Es werden insgesamt 2 ml jetzt sein. Transfer 1 ml der CHIII in THF-Lösung mit zwei separaten 1,5 ml Glasfläschchen mit einem Teflon beschichteten Kappen. Bewahren Sie die CHIII Lösung in einem 4-Grad-Kühlschrank bei einer Endkonzentration von 5 mg / ml. Diese Aliquots und Lösungen werden benutzt, um die Optodenmaterials machen. Pipette 66 ul von Bis (2-ethylhexyl) sebacat (DOS) in ein 1,5 ml-Glas mit einem Teflon beschichtet Schraubverschluss – das ist die Optode Durchstechflasche. DOS ist eine zähflüssige Lösung so ist darauf zu achten, die richtige Menge der Lösung zu gewährleisten, um die Flasche übertragen wird. Das Volumen entspricht ca. 60 mg des DOS. Abwiegen 30 mg hochmolekularer Poly (vinyl)-Chlorid (PVC) und übertragen diese auf die Optode Durchstechflasche. Fügen Sie nun die aliquotiert funktionalen Komponenten, die Optode Fläschchen, um die gewünschte Optode erstellen. Die relativen Konzentrationen von CHIII, Naix und NaTFPB bestimmt die Reaktion des Sensors auf Natrium. Diese Konzentrationen können angepasst werden, um einen Sensor, der im Idealfall reagiert auf Konzentrationen intrazellulären, mit einem Kd-Wert von 10 mM oder extrazelluläre Konzentrationen, mit einer Kd von 150 mm aufweisen. Zusätzlich wird es wahrscheinlich Charge zu Charge Schwankungen der Chemikalien vom Hersteller und Kalibrierung der Sensoren ist notwendig, um festzustellen, ob die richtige Antwort für jede neue Charge von chemischen Komponenten auftritt. Hier beschreiben wir die Methode, einen Sensor mit Konzentrationen, die üblicherweise für die intrazelluläre Natrium-Messungen werden zu schaffen. In einem Laborabzug, Transfer 100 ul der 5 mg / ml CHIII in THF-Lösung, die Optode Durchstechflasche. Lösen Sie 5 mg Naix in 300 ul THF und Transfer 300 pl der Optode Fläschchen, diese korreliert mit 5 mg Naix. Lösen Sie eine 5 mg Aliquot der NaTFPB in 500 ul THF und Transfer 20 ul der Lösung des Optode Fläschchen, diese korreliert mit 0,1 mg NaTFPB. Add 80 ul THF die Optode Durchstechflasche. Die Lösung in der Optode Durchstechflasche enthält 30 mg PVC, 60 mg DOS, 5 mg Naix, 0,2 mg NaTFPB, 0,5 mg CHIII in 500 ul von THF. Vorsichtig vortexen diese Phiole, bis alle PVC gelöst hat. Die Optode sollte eine rote Farbe. Der Gesamtbetrag der THF hinzugefügt, um die Durchstechflasche 500 ul unabhängig von dem Verhältnis der Komponenten verwendet werden. Lassen Sie die restliche THF in der Naix und NaTFPB Aliquots über Nacht und re-label das Rohr mit der richtigen Menge von chemischen verdampfen. 2. Erstellen Nanosensoren Je 100 ul 10 mg / ml 1,2-Distearoyl-sn-glycero-3-Phosphoethanolamin-N – [Methoxy (Polyethylenglykol) -550] in Chloroform (PEG-Lipid) in ein 4-DRAM-Glasflasche. Lassen Sie das Chloroform in einem Laborabzug verdampfen. Dieser Prozess kann durch Trocknen der Lösung mit Stickstoffgas oder Stallluft beschleunigt werden. 4 ml des gewünschten wässrigen Lösung in die Durchstechflasche mit PEG-Lipid. Legen Sie die Durchstechflasche auf einer Hebebühne unter dem Beschallung Spitze und heben Sie die Flasche, bis die Spitze ist ca. 7 mm tief in die Lösung und beschallen mit einer niedrigen Beschallung Strom für 30 Sekunden. Hier verwenden wir eine Branson digitalen sonifier auf 15% Amplitude mit einem ½-Zoll-Spitzendurchmesser Schritt Horn. Die wässrige Lösung kann eine Lösung sein. Zum Beispiel, um zu bestimmen, die Reaktion der Sensoren verwenden wir 10 mM HEPES pH 7,2 mit Trizma Basis. Während die Lösung wird beschallt wird, mischen 50 ul der Optodenmaterials mit 50 ul Dichlormethan in einem 0,6 ml Reaktionsgefäß. Mix mit der Pipette, um sicherzustellen, gleichmäßige Durchmischung. Passen Sie die sonifier Steuerung für 3 Minuten beschallt. Starten Sie die Beschallung und während Beschallung hinzufügen Optode Mischung Lösung für das Fläschchen durch Eintauchen der Pipettenspitze in die Lösung und Abgabe der 100 ul Lösung in einer schnellen, sogar Injektion. Die Lösung sollte blau, dependen auf die wässrige Lösung eingesetzt. Lassen Sie die Beschallung für ca. 30 Sekunden, dann weiter unten die Buchse, so dass die Beschallung Spitze ca. 2 mm tief in Lösung ist. Dies sollte damit beginnen, die Lösung zu belüften und die Lösung wird undurchsichtig. Dieser Schritt hilft, um das restliche THF und Dichlormethan aus der Lösung zu entfernen. Nach Beschallung abgeschlossen ist, ziehen Sie die Nanosensor Lösung in eine 5 ml Spritze. Bringen Sie eine 0,2 um Spritzenfilter und Abgeben der Nanosensor Lösung in einen Glaskolben mit Schraubverschluss Kappe. Die Lösung sollte klar und blau, wenn eine wässrige Lösung, die weniger als 10 mM Natrium enthält und einen pH-Wert weniger als 9 verwendet wird. Ansonsten sollte es keine Farb-oder rosa sein. 3. Bestimmen nanonsensor Antwort Diese Methode wird verwendet, um die Reaktion der Nanosensoren entwickelt, um intrazelluläre Natrium-Messung zu bestimmen. Unterschiedliche Konzentrationen wird empfohlen, für die extrazelluläre Natrium-Konzentration Nanosensoren eingesetzt werden. Machen Stammlösungen von 10 mM HEPES (0 Na) und 1 M Natriumchlorid (NaCl) in 10 mM HEPES (1 M Na) und pH-Wert jeder dieser Lösungen auf 7,2 mit Trizma Basis. Mix Stammlösungen von 0 Na und 1 M Na in 50 ml konische Röhrchen, um Lösungen mit zu erstellen: 0, 1, 5, 10, 20, 50, 100, 200, 500, 1000 mM NaCl-Konzentrationen. Verwenden Sie ein optisches Boden 96-Well-Platte, um die Reaktion zu bestimmen. 100 l von jeder Konzentration von Natrium zu 3 Brunnen in einer Spalte. Dies erzeugt ein Array von 3 x 10 Brunnen. Zu jedem Well 100 ul der frisch zubereiteten Nanosensoren und Last in einem Mikroplatten Fluorometer. Wir verwenden eine Molecular Devices Spectramax M3. Lesen Sie jede auch mit den folgenden Wellenlängen: Speisung (nm) Emission (nm) Cut-Off (nm) 488 570 530 488 670 610 639 680 665 Die Nanosensor Intensität bei jeder Wellenlänge ist abhängig von der Natrium-Konzentration. Die Verwendung der Wellenlänge hängt von den Anwendungen. Für intrazelluläre langsame Dynamik Messungen verwenden wir 488 nm/570 nm (Anregung / Emission) und 488 nm nm/670, die uns erlauben, Verhältnis der beiden Wellenlängen und Rauschen zu reduzieren. Traditionell wird Optode Daten zu einem Werte, die konvertiert werden: α = (I – I min) / (I max – I min), wo ich die Intensität an einem bestimmten Natrium-Konzentration, I min ist der niedrigste Intensität in der Antwort-Messungen und I max ist die höchste Intensität in der Antwort-Messungen. Convert entweder das Verhältnis der Intensität bei 570 nm durch die Intensität bei 670 nm oder die Intensität bei 680 nm zu α unterteilt. Verwenden Sie Plotten Software, Excel oder Origin typischerweise in unserem Labor benutzt, um α gegen den log der Natriumkonzentration Grundstück, Einstellung der log von Null-Natrium-Konzentration auf -1. Fit eine sigmoide Kurve, um die Antwort. Aus der Kurve, berechnet die Natrium-Konzentration bei α = 0,5, die die Konzentration, bei der der Sensor optimal reagiert darstellt. Passen Sie das Verhältnis von CHIII, Naix und NaTFPB in der Optode zu Nanosensoren mit optimaler Reaktion rund um die Natrium-Konzentration von Interesse zu erzeugen. 4. Intrazelluläre Bildgebung Für intrazelluläre Messungen werden die Nanosensoren in 5 mg / ml Glucose in Wasser und mikroinjiziert in die Zellen. Wachsen oder Übertragung Zellen zu einem Glasboden Schüssel oder ein bildgebendes Kammer mit einem Deckglas unten. Inkubieren Sie die Zellen in klaren Medien oder Tyrode-Lösung. Montieren Sie den Imaging-Kammer oder einen Teller auf einem Epifluoreszenzmikroskop. Wir verwenden ein Zeiss LSM 7 konfokalen Mikroskop. Pull Kapillare aus Glas mit einer Pipette Abzieher. Wir verwenden eine sutter flammenden braun p-97 mit 1 mm OD, 0,78 mm ID Glas, ein letzter Tipp Durchmesser rund 300-500 nm. Backfill die Pipette mit Nanosensor Lösung mit einer Spritze und einem Hamilton Nadel oder ein Mikrospitze Lader und eine Pipette. Montieren Sie die Pipette in eine Halterung, die an einem Mikromanipulator befestigt ist und mit einem Druck gesteuertes Einspritzsystem. Hier verwenden wir eine Burleigh EXFO PCS 6000 Mikromanipulator und ein Medical Systems Corporation Injektor. Senken Sie die Pipette auf der Zelle und in das Zytoplasma, manchmal ist es notwendig, "Tap" den Manipulator Halter zu durchdringen die Membran. Injizieren Sie die Lösung Nanosensor und schnell zurückziehen Pipette. 5. In-vivo-Bildgebung Alle Verfahren wurden überarbeitet und durch Northeastern University Animal Care und Verwenden Committee genehmigt. Nanosensorsfür in vivo, extrazelluläre Bildgebung sind in Phosphat aus Kochsalzlösung und angepasst, um eine optimale Reaktion auf Natrium in einer Natrium-Konzentration von 135 mm haben. Für die Injektion Set-up und die Abbildung der Fluoreszenz-Nanosensoren in Mäusen, verwenden wir die IVIS Lumina II und der damit verbundenen Narkose-Einheit. Desinfizieren Sie die Induktions-und Imaging-Kammern. Legen Sie CD1 Nacktmäusen (ca. 20g) in der Induktion Kammer und schützen Sie sie vor Isofluran. Der prozentuale Anteil von Isofluran und Sauerstoff verabreicht Durchfluss variiert je nach Art und Gewicht der Mäuse. Warten Sie, bis die Mäuse voll narkotisiert. Nach der Mäuse betäubt sind, entfernen Sie die Mäuse aus der Induktion Kammer und Ort in der Imaging-Kammer. Halten Sie den Mäusen unter Narkose. Für jede Maus, desinfizieren Sie die gewünschte Injektion Bereichen. Füllen Sie eine sterile 31G Insulinspritze mit 10 ul Nanosensoren achten Sie darauf, alle Luftblasen zu entfernen. Mit einer Pinzette fassen Sie eine kleine Hautfalte an der Rückseite der Maus auf die gewünschte Einstichstelle. Fassen Sie die Haut, die Spritze in die Haut mit der Fase nach oben, und die Nadel parallel zur Haut. Vor Injektion der Sensoren, ziehen wieder an der Spritze, damit die Nadel nicht in ein Blutgefäß eingeführt. Dann vorsichtig bewegen Sie die Nadel nach rechts und links, um eine Tasche in der Haut zu schaffen. Dies minimiert den Staudruck der die Sensoren ein Austreten aus der Injektionsstelle verursacht. Spritzen Sie die Sensoren und entfernen Sie vorsichtig die Spritze. Durch leichten Druck auf die Injektionsstelle und wischen Sie jede Lösung, die aus der Injektionsstelle können zugespielt haben. Dies minimiert die Fluoreszenz von Sensoren, die nicht in die Haut injiziert werden. Wiederholen Sie die Schritte 5,4 bis 5,7, bis die Anzahl der gewünschten Einspritz Bereichen erreicht ist. Sechs Injektionen gleichmäßig auf der linken und rechten Seite des Rückens verteilt werden empfohlen. Für jede einzelne Maus, ändern Nadeln, wenn die Nadel wird schwierig, in die Haut legen. Nadeln sollten nicht zwischen Mäusen geteilt werden. Dies wird die Übertragung von Krankheiten oder Kreuzkontamination zwischen Mäusen zu minimieren. Für die Bildgebung der Natrium-Fluoreszenz-Sensoren, so erwerben wir sowohl Hellfeld-und Fluoreszenz-Bilder von den Mäusen mit Filter setzt, dass die meisten eng aufeinander abgestimmt die 640 nm/680 nm (Anregung / Emission) Spektrum der Nanosensoren und minimieren auch die Autofluoreszenz der Haut. 6. Repräsentative Ergebnisse Abbildung 1. Ansprechkurven von fünf verschiedenen Nanosensor setzt auf Natrium. Jeder Satz stellt Nanosensoren aus verschiedenen Optode Formulierungen, die die gleiche Menge an CHIII, NaTFPB, PVC-und DOS, aber unterschiedliche Mengen an Naix hatte. Die Daten wurden auf α-Werte mit den 639/680 nm Intensitäten umgewandelt. Die Daten werden im Durchschnitt 3, Fehlerbalken weggelassen, mit einem ausgestattet sigmoide Kurve mit Origin. In dieser Kurve wurde die maximale Konzentration von Natrium verwendet 500 mM. Die Kd der Natrium-Nanosensoren für Natrium reichten von 10 mM (orange Diamanten) auf etwa 150 mM (schwarze Quadrate). Abbildung 2. Neonatalen Herzmuskelzellen injiziert. Die Zellen wurden auf Deckgläsern kultiviert, montiert auf einem Mikroskop und injiziert mit Natrium Nanosensoren. Dargestellt sind fluoreszierende (639 nm Anregung), Hellfeld, und Overlay. Beachten Sie, dass einige Sensor-Clustering, tritt aber die Zellen haben eine normale Morphologie, Sensoren haben in der gesamten Cytosol verbreitet und es gibt keine nukleare loading. Abbildung 3. Subkutane Injektion von Mäusen mit Natrium Nanosensoren. Neun verschiedene Injektionen von Natrium Nanosensoren wurden in das subkutane Raum von Nacktmäusen gemacht. Beide Hellfeld-und Fluoreszenz-Bilder (640/680) überlagert werden.