الفلورسنت النانوية لقياس تركيز ايون في النظم البيولوجية
Summary
وتستخدم جزيئات الفلورسنت المنتجة في المختبر للتركيز ايون ايون التصوير والتدفقات في النظم البيولوجية مثل خلايا السائل خلال الإشارات وخلالي خلال التوازن الفيزيولوجي.
Abstract
تنظيم محكم التوازن الأيوني في جميع أنحاء الجسم أمر ضروري للوقاية من الدول المنهكة مثل الجفاف. 1 وفي المقابل ، يتعين على تدفقات ايون السريع على المستوى الخلوي لبدء العمل في إمكانات الخلايا منفعل. تنظيم الصوديوم 2 يلعب دورا هاما في كل من هذه الحالات ، ولكن لا توجد حاليا طريقة لرصد مستمر مستويات الصوديوم في الجسم الحي 3 و 4 تحقيقات الصوديوم داخل الخلايا لا تعطي نتائج مماثلة لتحقيقات مفصلة الكالسيوم. في محاولة لملء كل من هذه الفراغات ، وضعت nanosensors الفلورسنت التي يمكن رصد تركيزات الصوديوم في المختبر والمجراة. 5،6 هذه المجسات تقوم على التكنولوجيا optode ايون انتقائية ، وتتألف من جزيئات البوليمر التي الملدن الاعتراف الصوديوم محددة هي جزء لا يتجزأ العناصر ، fluorophores الحموضة حساسة ، والمواد المضافة. 7-9 ميكانيكيا ، والاعتراف عنصر الصوديوم مقتطفات الصوديوم في الاستشعار. استخراج 10 هذا يسبب الحموضة fluorophore حساسة للافراج عن أيون الهيدروجين للحفاظ على الحياد في إطار استشعار المسؤول الذي يسبب التغيير في مضان. أجهزة الاستشعار الصوديوم هي انعكاس للانتقائية وأكثر من البوتاسيوم الصوديوم حتى بتركيزات عالية داخل الخلايا. 6 وهي مغلفة ما يقرب من 120 نانومتر في القطر مع والبولي ايثيلين جلايكول لنقل توافق مع الحياة. باستخدام تقنيات microinjection ، يمكن تسليم أجهزة الاستشعار في سيتوبلازم الخلايا حيث ثبت أنها لرصد ديناميات الصوديوم الزمانية والمكانية للضرب myocytes القلب. 11 بالإضافة إلى ذلك ، كما أنها تتبع في الوقت الحقيقي والتغيرات في تركيزات الصوديوم في الجسم الحي عند حقنه 3 تحت الجلد في الفئران وهنا ، يمكننا أن نفسر بالتفصيل وشرح منهجية لافتعال nanosensors الصوديوم الفلورسنت وشرح لفترة وجيزة من التطبيقات البيولوجية مختبرنا يستخدم nanosensors عن : لmicroinjection من أجهزة الاستشعار في الخلايا ، والحقن تحت الجلد من أجهزة الاستشعار في الفئران .
Protocol
Discussion
وينبغي تشكيل nanosensors اتخاذ أي أطول من 10 دقيقة مرة واحدة أحرز الحل optode وتجفف الدهون PEG. يمكن Optode ليس فقط عندما تكون هناك حاجة بسرعة ، ولكن عند تخزينها في 4 درجات مئوية ، وأنها يمكن أن تكون مستقرة لمدة شهور. أظهرنا أن nansensors ، التي تشكلت مرة واحدة ، هي مستقرة في محلول لمدة أسبوع على الأقل ، إلا أنه يجب توخي الحذر لمنع photobleaching خلال هذا الوقت من خلال منع nanosensors 6 من الضوء وبينما تظاهر nanosensors الصوديوم هنا ، تم optodes خلقت لأيونات بيولوجيا معظم ذات الصلة ، مثل البوتاسيوم وكلوريد. 10،12 لدينا أيضا تمديد هذه التكنولوجيا لجزيئات صغيرة مثل الجلوكوز. 13
بالإضافة إلى توليد nanosensors لرصد analytes مختلفة ، وهذه nanosensors قابلة للتغييرات أخرى من شأنها أن تجعل من المفيد لهم في معظم التجارب البيولوجية. على سبيل المثال ، طلاء السطح ، ويمكن في هذه الحالة بسهولة بولي (جلايكول الإثيلين) ، يمكن تغييرها باستخدام أي جزيء amphiphilic أن ذوبان في الماء. وهذا يتيح إمكانية functionalizing هذه الجسيمات النانوية لتطبيقات مختلفة أو الأهداف. ويمكن أيضا حجم جزيئات أن تعدل عن طريق تغيير طلاء السطح ، وشدة صوتنة أو استخدام المذيبات.
كانت مؤشرات الكالسيوم الفلورسنت لا تقدر بثمن في تحديد الخلايا إشارات الكالسيوم ، ولكن لا الأصباغ الصوديوم الحساسة المتوفرة لديهم نفس الخصائص المثالية. النانوية تهدف إلى توفير Optode طريقة بديلة لأيونات intracellularly التصوير تم في مجال التنمية لسنة 14 ونحن بنينا على هذه الأبحاث السابقة لإنشاء nanosensors محددة للتصوير الصوديوم داخل الخلية والذي نأمل أن توفر وسيلة لفهم الكيفية التي تؤثر إشارات الصوديوم الخلوية وظيفة تعديلات في الإشارة التي تؤدي إلى أمراض معينة.
استخدام nanosensors الفلورسنت في الجسم الحي يوفر الوقت الحقيقي بديل عن الحد الأدنى الغازية analytes الرقابة على وسائل أخرى مثل الدم تلفت ، وقد أظهرت 3 الصوديوم والجلوكوز nanosensors على أساس التكنولوجيا أعلاه لتعقب التغييرات في الصوديوم والجلوكوز ، على التوالي في فيفو. 3،13 ومع ذلك ، توجد حاليا قيود على هذا الأسلوب كأداة للرصد. على سبيل المثال ، يجب أن تحتوي على أجهزة استشعار fluorophore مع طائفة تحول نحو كاف الحمراء الأشعة تحت الحمراء بالقرب من أجل تقليل تألق ذاتي خلفية من الجلد 15 ثانيا ، تقنية الحقن الحالية لا تنتج حقن الموحد للnanosensors التي قد تنجم عن مثل هذه أخطاء والاختلاف في عمق الحقن. على الرغم من هذه القيود ، ويمكن تطوير هذه nanosensors الفلورسنت ومظاهرتهم ناجحة جعل هذه المجسات أداة بحث لا تقدر بثمن وطريقة لرصد صحة المريض.
Disclosures
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
وتمول وJMD MKB من خلال العلوم لطب النانوي IGERT وبرنامج التكنولوجيا في جامعة نورث إيسترن (بتمويل من لجنة التحقيق الوطنية وجبهة الخلاص الوطني منحة DGE – 0504331). كما تم تمويل هذا العمل من قبل المعاهد الوطنية للصحة والمعهد الوطني الطبي العام R01 المنح العلوم GM084366. ونحن نشكر أيضا Saumya داس وانطوني روزنزويج من BIDMC في بوسطن لتوفير myocytes القلب والنقدي كيفن لمساهمته في تطوير بروتوكول الحيوان.
Materials
| Product Name | Company | Catalogue Number | Comments |
|---|---|---|---|
| IVIS Lumina II Instrument Package | Caliper Life Sciences | 126273 | |
| CD-1 Nude Mice | Charles River | Strain Code: 086 | Immunodeficient |
| Insulin syringes | BD | 328438 | 3/10 ccmL , 8mm, 31G |
| High Molecular Weight PVC | Sigma | ||
| DOS | Sigma | ||
| CHIII | Sigma | ||
| NaTFPB | Sigma | ||
| NaIX | Sigma | ||
| Thin walled capillary glass | Sutter | ||
| PEG lipid | Avanti Polar Lipids |
Table 1. Provides a list of chemicals and equipment used in this procedure. All common chemicals not listed were purchased from Sigma.
References
- Adrogue, H. J., Madias, N. E. Hyponatremia. N Engl J Med. 342, 1581-1589 (2000).
- Kim, D. Y. BACE1 regulates voltage-gated sodium channels and neuronal activity. Nat Cell Biol. 9, 755-764 (2007).
- Dubach, J. M., Lim, E., Zhang, N., Francis, K. P., Clark, H. in vivo sodium concentration continuously monitored with fluorescent sensors. Integr Biol (Camb). , (2010).
- Minta, A., Tsien, R. Y. Fluorescent indicators for cytosolic sodium. J Biol Chem. 264, 19449-19457 (1989).
- Dubach, J. M., Harjes, D. I., Clark, H. A. Ion-selective nano-optodes incorporating quantum dots. Journal of the American Chemical Society. 129, 8418-8418 (2007).
- Dubach, J. M., Harjes, D. I., Clark, H. A. Fluorescent ion-selective nanosensors for intracellular analysis with improved lifetime and size. Nano Letters. 7, 1827-1831 (1021).
- Schaffar, B., Wolfbeis, O. A sodium-selective optrode. Mikrochim Acta III. III, 109-109 (1989).
- Seiler, K. Characterization of sodium-selective optode membranes based on neutral ionophores and assay of sodium in plasma. Clin Chem. 37, 1350-1355 (1991).
- Zhujun, Z., Mullin, J., Seitz, W. Optical sensor for sodium based on ion-pair extraction and fluorescence. Anal Chim Acta. 184, 251-251 (1986).
- Bakker, E., Buhlmann, P., Pretsch, E. Carrier-Based Ion-Selective Electrodes and Bulk Optodes. 1. General Characteristics. Chem Rev. 97, 3083-3132 (1997).
- Dubach, J. M., Das, S., Rosenzweig, A., Clark, H. A. Visualizing sodium dynamics in isolated cardiomyocytes using fluorescent nanosensors. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 106, 16145-16150 (2009).
- Harjes, D. I., Dubach, J. M., Rosenzweig, A., Das, S., Clark, H. A. Ion-Selective Optodes Measure Extracellular Potassium Flux in Excitable Cells. Macromolecular Rapid Communications. 31, 217-221 (2010).
- Balaconis, M. K., Billingsley, K. L., Dubach, J. M., Clark, H. A. . , .
- Park, E. J., Brasuel, M., Behrend, C., Philbert, M. A., Kopelman, R. Ratiometric optical PEBBLE nanosensors for real-time magnesium ion concentrations inside viable cells. Anal Chem. 75, 3784-3791 (2003).
- Frangioni, J. V. in vivo Near-Infrared Fluorescence Imaging. Curr Op Chem Biol. 7, 626-634 (2003).
