Biyolojik Sistemleri İyon Konsantrasyon Ölçümü için Floresan Nanopartiküller

1. Optode, hazırlanması Optode yapmadan önce, bileşenlerin hacimde kolaylıkla ölçülebilir ve saklanabilir ki bu yüzden ihtiyacı vardır. 50 mg Sodyum İyonofor X (NaIX) flakon ve 50 mg sodyum Tetrakis [3,5-bis (triflorometil) fenil] borat (NaTFPB) her tetrahyrdofuran (THF) büyümüş ve 1.5 ml polistiren santrifüj tüplerine içine aliquoted olacaktır. Kimyasal bir davlumbaz, nakliye flakon THF 1 ml, 50 mg NaIX çözülür ve katı tamamen çözülmüş olduğundan emin olmak için karıştırın. Bu çözüm ul 100 10 ayrı santrifüj tüplerine aktarın. NaTFPB için tekrarlayın. THF, gecede bir kimyasal davlumbaz buharlaşması santrifüj tüplerine etiket ve depolama için 4 derecelik buzdolabı onları yere bırakın. Bu kuru NaIX ve NaTFPB 5 mg alikotları oluşturur. 1 ml THF Chromoionophore III (CHIII) çözülür ve 3 ml'lik cam flakon transfer. CHIII nakliye flakon herhangi bir kalıntı CHIII çözülür ve 3 ml'lik cam flakon eklemek için başka bir 1 ml THF ekleyin. Şu anda toplam 2 ml olacak. Teflon kaplı kapaklar ile iki ayrı 1.5 ml cam şişe 1 ml THF çözüm CHIII aktarın. CHIII çözümü son 5 mg / ml konsantrasyonda 4 derece buzdolabında saklayın. Bu alikot ve çözümler optode malzeme yapmak için kullanılır. Teflon kaplamalı vidalı kapaklı bir 1.5 ml cam şişenin içine Pipet 66 ul bis (2-etilheksil) sebacate (DOS) – Bu optode flakon. DOS viskoz bir çözümdür böylece flakon aktarılır çözüm uygun miktarda sağlamak için dikkat edilmelidir. Hacmi DOS ~ 60 mg karşılık gelir. Yüksek molekül ağırlıklı poli (vinil) klorür (PVC) 30 mg tartılır ve optode flakon için bu transferi. Şimdi aliquoted işlevsel bileşenleri istenilen optode oluşturmak için optode flakon eklemek. CHIII, NaIX ve NaTFPB göreceli konsantrasyonları sodyum sensörü yanıt belirleyecektir. Bu konsantrasyonları, ideal Kd 150 mM, 10 mM veya ekstrasellüler konsantrasyonları Kd ile konsantrasyonları hücre içi yanıt bir sensör için ayarlanabilir. Ayrıca, büyük olasılıkla, sensörler satıcı ve kalibrasyon kimyasalların toplu değişkenlik toplu kimyasal bileşenleri her yeni parti için doğru tepki oluşup oluşmadığını belirlemek için gerekli olacaktır. Burada genellikle intraselüler sodyum ölçümleri için kullanılan konsantrasyonlarda bir sensör oluşturmak için bir yöntem tarif. Kimyasal bir davlumbaz, THF çözüm optode flakon 5 mg / ml CHIII 100 ul aktarın. THF 300 ul NaIX 5 mg çözülür ve bu ilişkilendiren NaIX 5 mg optode flakon 300 ul transfer. THF 500 ul 5 mg NaTFPB bir kısım çözülür ve 0.1 mg NaTFPB optode flakon, bu ilişkilendiren çözüm 20 ul transfer. THF 80 ul optode flakon ekleyin. Optode flakon çözüm PVC, DOS 60 mg, 5 mg NaIX NaTFPB, THF 500 ul CHIII 0.5 mg, 0.2 mg 30 mg içerir. PVC kadar yavaşça girdap bu flakon çözünmüş vardır. Optode kırmızı bir renk olmalıdır. THF toplam tutarı ne olursa olsun kullanılan bileşenlerin oranı 500 mcL olmalıdır flakon ekledi. NaIX ve NaTFPB alikot kalan THF gecelik ve yeniden-etiket tüp kimyasal doğru miktarda buharlaşmaya bırakın. 2. Nanosensors Oluşturma Pipet 100 ul 10 mg / ml 1,2-Distearoyl-sn-Glycéro-3-Phosphoethanolamine-N – 4 dram cam şişenin içine kloroform [metoksi (polietilenglikol) -550] (PEG-lipit). Kloroform, kimyasal bir davlumbaz buharlaşmaya bırakın. Bu süreç, çözüm, azot gazı veya ev hava ile kurutulması ile hızlandırılmış olabilir. Için istenen sulu çözelti PEG-lipit flakon 4 ml ekleyin. Sonicating ucu altından bir laboratuvar jack flakon yerleştirin ve ucu çözümü 7 mm derinliğinde ve 30 saniye kadar düşük sonication güç sonikasyon flakon yükseltmek. Burada ½ inç ucu çapı adım korna ile% 15 genlik kümesi Branson dijital sonifier kullanın. Sulu çözelti herhangi bir çözüm olabilir. Örneğin, biz trizma tabanı ile 10 mM HEPES pH 7,2 sensörleri yanıt belirlemek için. Çözüm sonicated edilirken, 0.6 ml mikrosantrifüj tüp diklorometan 50 ul optode malzeme 50 ul karıştırın. Hatta karışmasını sağlamak için pipet ile karıştırın. 3 dakika boyunca sonikasyon sonifier kontrolü ayarlayın. Sonication başlatın ve sonicating ise çözüm pipet içine çeker ve bir hızlı, hatta enjeksiyon 100 ul çözüm dağıtım flakonuna optode karışımı çözümü eklemek. Çözüm mavi, Depe açmalısınızkullanılan sulu çözelti bulgu. Sonication sonra yaklaşık 30 saniye boyunca devam sonicating ucu çözüm derin yaklaşık 2 mm jack böylece düşürmek için izin verin. Bu çözüm havalandırmak için başlamalıdır ve çözüm opak hale gelecektir. Bu adım, kalan THF ve diklorometan çözüm kaldırmak için yardımcı olur. Sonication tamamlandıktan sonra, 5 ml enjektör içine nanosensor çözüm yukarı çekin. 0.2 mikron şırınga filtresi takın ve nanosensor çözüm vidalı üst kapak ile bir cam şişenin içine dağıtmak. Az 10 mM sodyum içerir ve yaklaşık 9 yıldan az bir pH değerine sahiptir sulu bir çözüm ise çözüm, berrak ve mavi olmalıdır. Aksi takdirde, hiçbir renk ya da pembe olmalıdır. 3. Nanonsensor yanıt Belirlenmesi Bu yöntem, hücre içi sodyum ölçmek için tasarlanmış nanosensors yanıtı belirlemek için kullanılır. Ekstrasellüler sodyum konsantrasyonu nanosensors için farklı konsantrasyonlarda kullanılması önerilir. 10 mM HEPES (0 Na) ve 10 mM HEPES (1 M Na) ve pH Bu çözümlerin her biri 7.2 trizma tabanı kullanarak 1M sodyum klorür (NaCl) stok çözümleri olun. 0, 1, 5, 10, 20, 50, 100, 200, 500, 1000 mM NaCl konsantrasyonları: çözümleri oluşturmak için 50 ml konik santrifüj tüplerine 0 Na ve 1 M Na stok çözümleri karıştırın. Yanıtı belirlemek için bir optik alt 96 plaka kullanın. Her bir sütun 3 kuyu sodyum konsantrasyonu 100 ul ekleyin. Bu 3 x 10 kuyu bir dizi üretecek. Her biri için de 100 taze hazırlanmış nanosensors ul ve bir mikroplak flüorometre yük ekleyin. Biz Moleküler Cihazlar SPECTRAmax M3 kullanın. Aşağıdaki dalga boylarında her iyi okuyun: Tahrik olma (nm) Emisyon (nm) Cut-Off (nm) 488 570 530 488 670 610 639 680 665 Her bir dalga boyunda nanosensor yoğunluğu sodyum konsantrasyonuna bağlıdır. Dalga boyu kullanımı uygulamaları bağlıdır. Intrasellüler yavaş dinamikleri ölçümleri için, biz, 488 nm/570 nm (uyarma / emisyon) ve oranı iki dalga boyları için bize izin ve gürültüyü azaltmak 488 nm/670 nm kullanın. Geleneksel olarak, optode veri bir değerlere dönüştürülür: a = (I – I min) / (I max – I min), belirli bir sodyum konsantrasyonu yoğunluğu nerede, ben min yanıt ölçümlerde en düşük yoğunluk ve ben max yanıt ölçümleri en yüksek yoğunluğu. Yoğunluk oranı, 670 nm yoğunluğu veya α ile 680 nm'de yoğunluğu bölünmüş 570 nm ya dönüştürün. -1 'Den sıfır sodyum konsantrasyonu günlük, günlük sodyum konsantrasyonu karşı α çizmek için, Excel veya Menşei genellikle laboratuarda kullanılan ya komplo yazılımı kullanın. Bir sigmoid eğri yanıt sığdır. Eğri, sensör en iyi şekilde karşılık verir konsantrasyon temsil = 0.5 α az sodyum konsantrasyonunun hesaplanması. Nanosensors ilgi sodyum konsantrasyonu etrafında optimal cevabı oluşturmak için optode CHIII, NaIX ve NaTFPB oranı ayarlayın. 4. Hücre içi görüntüleme Hücre içi ölçümler için, suda 5 mg / ml glikoz nanosensors yapılır ve hücrelerin içine microinjected. Büyü ya da bir bardak alt yemek veya bir bardak lamel alt ile bir görüntüleme odası hücreleri aktarmak. Net medya ya da Tyrode çözümü hücrelerin inkübe edin. Görüntüleme odası veya çanak Epifloresans bir mikroskop üzerine monte edin. Biz Zeiss LSM 7 konfokal mikroskop kullanıyoruz. Bir pipet çektirmesi ile kılcal cam çekin. Biz son bir ucu çapı yaklaşık 300-500 nm, 1 mm OD, 0.78 mm ID cam kahverengi p-97 alevli bir Sutter kullanın. Dolgu nanosensor, bir şırınga ve Hamilton iğne kullanarak çözüm, ya da bir mikrotip yükleyici ve bir pipet pipet. Pipet bir micromanipulator bağlı bir basınç kontrollü enjeksiyon sistemine bağlı bir tutucunun içine monte edin. Burada bir Burleigh EXFO PCS 6000 mikromanipülatör ve medikal sistemler şirketi enjektör kullanın. Hücrenin üstüne pipet Alt ve sitoplazma içine, bazen de delmek için membran manipülatör tutucu "tap" için gereklidir. Nanosensor çözüm enjekte edilir ve hızlı pipet geri. 5. in vivo görüntüleme Tüm işlemler, Northeastern Üniversitesi Hayvan Bakımı ve Kullanımı Komitesi tarafından gözden geçirilmiş ve onaylanmıştır . Nanosensorsin vivo olarak, ekstrasellüler görüntüleme fosfat tamponlu tuz ve sodyum konsantrasyonu 135 mM sodyum optimal bir yanıt var ayarlanabilir. Enjeksiyon set-up ve floresan nanosensors farelerde görüntüleme için, IVIS Lumina II ve ilişkili anestezi ünitesi kullanır. Indüksiyon ve görüntüleme odaları dezenfekte edin. Indüksiyon odasına yerleştirin CD1 çıplak farelerin (yaklaşık 20g) ve izofluran için bunları ortaya çıkarmak. Uygulandığında izofluran ve oksijen akış hızı yüzde farelerin türleri ve ağırlığına bağlı olarak değişir. Fareler tamamen anestezi olmak için bekleyin. Fareler anestezi sonra fareler, indüksiyon odası ve yerden görüntüleme odasına çıkarın. Fareler anestezi altında tutun. Her fare için, istenilen enjeksiyon alanları dezenfekte edin. Tüm hava kabarcıklarını çıkarmak için emin olun nanosensors 10 mcL ile steril bir 31G insülin enjektörü doldurun. Forseps kullanarak, istenilen enjeksiyon yerinde fare sırtı boyunca cilt kat küçük bir kavramak. Cilt açgözlü iken, yukarı gelecek şekilde eğim ve cilde paralel iğne ile cilt içine şırınga takın. Sensörler enjekte önce, bir kan damarı içine iğne takılı olduğundan emin olmak için şırınga pistonu geri çekin. Sonra, yavaşça iğne doğru hareket eder ve deri içinde bir cep oluşturmak için sol. Bu sensörleri enjeksiyon yerinde sızıntı neden geri basınç en aza indirecektir. Sensörler enjekte şırınga ve yavaşça çıkarın. Enjeksiyon yerinde hafifçe basınç uygulayın ve enjeksiyon yerinde dışarı sızdırılmış olabilir herhangi bir çözüm silerek temizleyin. Bu cilt içine enjekte sensörlerden gelen floresan en aza indirecektir. Istenen enjeksiyon alanların sayısı ulaşana kadar tekrarlar 5.7 ile 5.4 adım. Arka sağ ve sol tarafta eşit aralıklı altı enjeksiyon siteleri tavsiye edilir. Iğne deri içine eklemek için zor olur, her bir fare için, iğneler değiştirin. İğneler fareler arasında paylaşılan olmamalıdır. Fareler arasında hastalık bulaşma veya çapraz kontaminasyon en aza indirecektir. Görüntüleme sodyum floresan sensörleri için, en yakın 640 nm/680 nm (uyarma / emisyon) nanosensors spektrumu uyumlu ve aynı zamanda cilt otofloresans en aza indirmek filtre setlerini kullanarak farelerde aydınlık ve floresan görüntü kazanır. 6. Temsilcisi Sonuçlar Şekil 1 sodyum beş farklı nanosensor setleri cevabı eğrileri. Her set CHIII, NaTFPB, PVC ve DOS aynı miktarda ama NaIX değişen miktarlarda farklı optode formülasyonları nanosensors temsil eder. Veri 639/680 nm şiddetlerini kullanarak α değerlere dönüştürülür. Veri Kökeni kullanarak monte sigmoid eğri, açıklık için atlanmış 3, hata çubukları ortalama. Bu yanıt eğrisi, maksimum kullanılan sodyum konsantrasyonu 500 mM oldu. Sodyum sodyum nanosensors Kd 10 mM (turuncu elmas) hakkında 150 mM (siyah kareler) arasında değişmekteydi. Şekil 2 yenidoğan kardiyak miyositler Injected. Hücreler, coverglass kültür mikroskop üzerine monte edilmiş ve sodyum nanosensors ile enjekte edildi. Floresan (639 nm uyarım), aydınlık ve bindirme gösterilir. Not bazı sensör kümeleme oluşur, ancak hücreleri sensörleri sitoplazmada her tarafına nüfuz etmiş ve hiçbir nükleer yükleme var, normal morfoloji var. Şekil 3 sodyum nanosensors farelerin Subkutan enjeksiyon. Çıplak farelerin subkutan uzaya sodyum nanosensors Dokuz farklı enjeksiyonları yapıldı. Parlak bir alan ve floresan görüntüleri (640/680), üst üste.