Kültür MSS Nöronlar Dendritik Omurga Morfoloji Analizi
Summary
Çok sayıda yeni çalışmalar sinaptik proteinlerin beyin patolojileri ile ilişkili mutasyonlar belirledik. Primer kültür kortikal nöronların dendritik omurga morfoloji ve motilite bu hastalıkla ilişkili proteinlerin etkilerini inceleyen büyük esneklik sunar.
Abstract
Dendritik dikenler, beynin içinde eksitatör bağlantılarının büyük çoğunluğu siteleri, ve sinapsların post-sinaptik gözü formu. Bu yapılar aktin zengin ve son derece dinamik olduğu gösterilmiştir. Klasik Hebbian plastisite nöromodülatör sinyallerinin yanı sıra tepki olarak, dendritik dikenler şekli ve sayısı, arıtma ve nöral devrelerin beynin içinde bilgi işleme ve depolama için kritik olduğu düşünülmektedir değiştirebilirsiniz. Dendritik dikenler içinde, proteinlerin karmaşık bir ağ dendritik omurga morfolojisi ve sayısının kontrolü sağlayan aktin cyctoskeleton ekstrasellüler sinyaller bağlantı. Nöropatolojik çalışmalar, şizofreni, otizm spektrum bozuklukları arasında değişen bir dizi hastalık durumlarında, anormal dendritik omurga morfolojisi veya numaraları görüntülemek göstermiştir. Ayrıca, son genetik çalışmalar, bu proteinlerin, kısmen, bu bozuklukların patofizyolojisinde altında yatan anormal omurga plastisite katkıda bulunabilir önerileri yol sinaptik proteinleri kodlayan birçok genlerindeki mutasyonlar belirledik. Dendritik omurga morfolojileri / sayısını kontrol etmek, bu proteinlerin potansiyel rolünü araştırmak için, kültürlü kortikal nöronların kullanımı çeşitli avantajlar sunuyor. Birincisi, bu sistem sabit hücreleri dendritik dikenler yüksek çözünürlüklü görüntüleme gibi canlı hücreler zaman atlamalı görüntüleme için izin verir. İkincisi, in vitro sistemde bu mutant protein, shRNA yapıları tarafından demonte veya farmakolojik tedaviler ifade protein fonksiyonunun kolay manipülasyon için sağlar. Bu teknikler, araştırmacılar, hastalıkla ilişkili proteinlerin rolünü incelemek ve mutasyonlar bu proteinlerin in vivo fonksiyonu nasıl tahmin başlamak için izin verir.
Protocol
Discussion
Bu teknikler, neuropathologies için katkıda bulunabilir post-sinaptik mekanizmalarının etkilerini anlamak üzerine odaklı dendritik omurga morfolojisi, sabit veya canlı birincil kortikal nöronların lineer yoğunluk ve motilite ayrıntılı kantitatif analiz için yukarıda anlatılan. Benzer bir yaklaşım, hipokampal piramidal, Purkinje, ya da orta dikenli bir nöronlar da dahil olmak üzere herhangi bir dikenli bir nöron omurga morfolojisi ve motilitesi, ölçmek için kullanılabilir.
<p class="jove_cont…Disclosures
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
Kelly Jones Biz dikkatli bir düzenleme için teşekkür ederim. Amerikan Kalp Derneği Doktora Sonrası Bursu (DPS);; Bu çalışma NIH hibe R01MH 071.316, Alzheimer Derneği, Şizofreni ve Depresyon (NARSAD) Araştırma Ulusal İttifak, ve Otizm Araştırma Ulusal İttifak (naar) (PP) tarafından desteklenen edildi Amerikan Kalp Derneği predoctoral Bursu (KMW).
Materials
| Name of the reagent | Company | Catalogue number | Comments (optional) |
|---|---|---|---|
| 18 mm round Cover glass No. 1.5 | Warner Instruments | 64-0714 (CS-18R15) | |
| 22 mm square Cover glass No. 1.5 | Warner Instruments | 64-0721 (CS-22S15) | |
| Poly-D-Lysine | Sigma | P-0899 | MW 70~150 Kda |
| Neurobasal Media | Invitrogen | 21103049 | |
| B27 | Invitrogen | 17504044 | |
| Glutamine | Invitrogen | 21051024 | |
| Penicillin-Streptomycin | Invitrogen | 15140148 | |
| D,L-APV (AP-5) | Ascent Scientific | Asc-004 | |
| Lipofectamine 2000 | Invitrogen | 11668019 | |
| DMEM | Invitrogen | 11965092 | |
| HEPES | MediaTech Cellgro | 25-060-C 1 | 1M, pH 7 |
| Formaldehyde Solution | EMD Chemicals | FX0415-5 | 36%, Histology grade |
| Normal Goats Serum | VWR | 100188-514 | Jackson Immunoresearch Labs |
| Triton X-100 | Fisher Scientific | AC21568-2500 | Acros Organics |
| Alexa Fluor 488 goat anti-mouse IgG (H+L) highly cross-adsorbed | Invitrogen | A-11029 | |
| Alexa Fluor 488 goat anti-rabbit IgG (H+L) *highly cross-adsorbed* | Invitrogen | A-11034 | |
| ProLong Gold antifade reagent | Invitrogen | P36934 | Special Packaging |
| Enclosed imaging stage chamber | Warner | RC-30HV | |
| Temperature controller unit | Warner | TC-344B | |
| MetaMorph | Universal Imaging |
References
- Banker, G., Goslin, K. Developments in neuronal cell culture. Nature. 336, 185-186 (1988).
- Xie, Z. Kalirin-7 controls activity-dependent structural and functional plasticity of dendritic spines. Neuron. 56, 640-656 (2007).
- Spear, L. Modeling adolescent development and alcohol use in animals. Alcohol Res Health. 24, 115-123 (2000).
- Srivastava, D. P., Woolfrey, K. M., Liu, F., Brandon, N. J., Penzes, P. Estrogen receptor ss activity modulates synaptic signaling and structure. J Neurosci. 30, 13454-13460 (2010).
- Srivastava, D. P. Rapid enhancement of two-step wiring plasticity by estrogen and NMDA receptor activity. Proc Natl Acad Sci USA. 105, 14650-14655 (2008).
- Woolfrey, K. M. Epac2 induces synapse remodeling and depression and its disease-associated forms alter spines. Nat Neurosci. 12, 1275-1284 (2009).
- Allison, D. W., Gelfand, V. I., Spector, I., Craig, A. M. Role of actin in anchoring postsynaptic receptors in cultured hippocampal neurons: differential attachment of NMDA versus AMPA receptors. J Neurosci. 18, 2423-2436 (1998).
- Harms, K. J., Tovar, K. R., Craig, A. M. Synapse-specific regulation of AMPA receptor subunit composition by activity. J Neurosci. 25, 6379-6388 (2005).
- Xie, Z., Huganir, R. L., Penzes, P. Activity-dependent dendritic spine structural plasticity is regulated by small GTPase Rap1 and its target AF-6. Neuron. 48, 605-618 (2005).
- Jones, K. A. Rapid modulation of spine morphology by the 5-HT2A serotonin receptor through kalirin-7 signaling. Proc Natl Acad Sci USA. 106, 19575-19580 (1957).
- Dunaevsky, A., Tashiro, A., Majewska, A., Mason, C., Yuste, R. Developmental regulation of spine motility in the mammalian central nervous system. Proc Natl Acad Sci USA. 96, 13438-13443 (1999).
- Lichtman, J. W., Conchello, J. A. Fluorescence microscopy. Nat Methods. 2, 910-919 (2005).
- Svoboda, K. Do spines and dendrites distribute dye evenly. Trends Neurosci. 27, 445-446 (2004).
