تحليل الصرف العمود الفقري شجيري الخلايا العصبية في الجهاز العصبي المركزي لؤلؤ
Summary
وقد حددت الدراسات التي أجريت مؤخرا العديد من الطفرات في البروتينات المرتبطة متشابك أمراض الدماغ. الابتدائية العصبونات القشرية مثقف توفر مرونة كبيرة في دراسة الآثار المترتبة على هذه البروتينات المرتبطة بمرض في العمود الفقري شجيري التشكل والحركة.
Abstract
شجيري العمود الفقري هي مواقع للغالبية من الاتصالات مثير داخل الدماغ ، وشكل المقصورة بعد متشابك من نقاط الاشتباك العصبي. هذه الهياكل هي غنية في أكتين ولقد ثبت أن تكون ديناميكية للغاية. استجابة لدونة Hebbian الكلاسيكية فضلا عن إشارات neuromodulatory ، يمكن تغيير شكل العمود الفقري شجيري والرقم ، وهو ما يعتقد أنه سيكون حاسما لتنقيح الدوائر العصبية ومعالجة وتخزين المعلومات في الدماغ. ضمن العمود الفقري شجيري ، وهي شبكة معقدة من البروتينات خارج الخلية إشارات الارتباط مع cyctoskeleton أكتين السماح للسيطرة على التشكل شجيري العمود الفقري والعدد. وقد أثبتت الدراسات Neuropathological أن عددا من الحالات المرضية ، بدءا من الفصام لاضطرابات طيف التوحد ، وعرض غير طبيعي التشكل العمود الفقري شجيري أو أرقام. علاوة على ذلك ، وقد حددت الدراسات الجينية الأخيرة طفرات في الجينات التي تكود بروتينات عديدة متشابك ، مما أدى إلى اقتراحات بأن هذه البروتينات يمكن أن تسهم في مرونة العمود الفقري الذي الشاذة ، في جزء منه ، الفيزيولوجيا المرضية الكامنة وراء هذه الاضطرابات. من أجل دراسة الدور المحتمل لهذه البروتينات في السيطرة morphologies العمود الفقري شجيري / العدد ، واستخدام الخلايا العصبية مثقف القشرية يوفر مزايا عدة. أولا ، وهذا النظام يسمح التصوير ذات الدقة العالية في العمود الفقري في الخلايا الجذعية الثابتة ، فضلا عن الوقت الفاصل بين التصوير من الخلايا الحية. ثانيا ، هذا النظام في المختبر يسمح للتلاعب السهل وظيفة البروتين التعبير عن البروتينات المشوهة ، التي يبني shRNA ضربة قاضية ، أو العلاجات الدوائية. هذه التقنيات تسمح للباحثين أن تبدأ في تشريح دور الأمراض المرتبطة البروتينات والتنبؤ بكيفية حدوث طفرات من هذه البروتينات قد تعمل في الجسم الحي.
Protocol
Discussion
وصف تقنيات أعلاه لتحليل كمي مفصل لمورفولوجيا شجيري العمود الفقري ، والكثافة الخطي والحركة في أي من الخلايا العصبية ثابتة أو العيش القشرية الأولية وتركز على فهم آثار ما بعد متشابك الآليات التي قد تسهم في neuropathologies. ويمكن استخدام نهج مماثل لتحديد مورفولوجيا العمود الف…
Disclosures
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
نشكر كيلي جونز للتحرير الدقيق. وأيد هذا العمل من قبل المعاهد الوطنية للصحة منح R01MH 071316 ، جمعية الزهايمر ، والتحالف الوطني لأبحاث الفصام والاكتئاب (NARSAD) ، والتحالف الوطني لأبحاث مرض التوحد (NAAR) (PP) ؛ الأمريكية زمالة جمعية القلب ما بعد الدكتوراه (DPS) ؛ الأمريكية زمالة جمعية القلب Predoctoral (KMW).
Materials
| Name of the reagent | Company | Catalogue number | Comments (optional) |
|---|---|---|---|
| 18 mm round Cover glass No. 1.5 | Warner Instruments | 64-0714 (CS-18R15) | |
| 22 mm square Cover glass No. 1.5 | Warner Instruments | 64-0721 (CS-22S15) | |
| Poly-D-Lysine | Sigma | P-0899 | MW 70~150 Kda |
| Neurobasal Media | Invitrogen | 21103049 | |
| B27 | Invitrogen | 17504044 | |
| Glutamine | Invitrogen | 21051024 | |
| Penicillin-Streptomycin | Invitrogen | 15140148 | |
| D,L-APV (AP-5) | Ascent Scientific | Asc-004 | |
| Lipofectamine 2000 | Invitrogen | 11668019 | |
| DMEM | Invitrogen | 11965092 | |
| HEPES | MediaTech Cellgro | 25-060-C 1 | 1M, pH 7 |
| Formaldehyde Solution | EMD Chemicals | FX0415-5 | 36%, Histology grade |
| Normal Goats Serum | VWR | 100188-514 | Jackson Immunoresearch Labs |
| Triton X-100 | Fisher Scientific | AC21568-2500 | Acros Organics |
| Alexa Fluor 488 goat anti-mouse IgG (H+L) highly cross-adsorbed | Invitrogen | A-11029 | |
| Alexa Fluor 488 goat anti-rabbit IgG (H+L) *highly cross-adsorbed* | Invitrogen | A-11034 | |
| ProLong Gold antifade reagent | Invitrogen | P36934 | Special Packaging |
| Enclosed imaging stage chamber | Warner | RC-30HV | |
| Temperature controller unit | Warner | TC-344B | |
| MetaMorph | Universal Imaging |
References
- Banker, G., Goslin, K. Developments in neuronal cell culture. Nature. 336, 185-186 (1988).
- Xie, Z. Kalirin-7 controls activity-dependent structural and functional plasticity of dendritic spines. Neuron. 56, 640-656 (2007).
- Spear, L. Modeling adolescent development and alcohol use in animals. Alcohol Res Health. 24, 115-123 (2000).
- Srivastava, D. P., Woolfrey, K. M., Liu, F., Brandon, N. J., Penzes, P. Estrogen receptor ss activity modulates synaptic signaling and structure. J Neurosci. 30, 13454-13460 (2010).
- Srivastava, D. P. Rapid enhancement of two-step wiring plasticity by estrogen and NMDA receptor activity. Proc Natl Acad Sci USA. 105, 14650-14655 (2008).
- Woolfrey, K. M. Epac2 induces synapse remodeling and depression and its disease-associated forms alter spines. Nat Neurosci. 12, 1275-1284 (2009).
- Allison, D. W., Gelfand, V. I., Spector, I., Craig, A. M. Role of actin in anchoring postsynaptic receptors in cultured hippocampal neurons: differential attachment of NMDA versus AMPA receptors. J Neurosci. 18, 2423-2436 (1998).
- Harms, K. J., Tovar, K. R., Craig, A. M. Synapse-specific regulation of AMPA receptor subunit composition by activity. J Neurosci. 25, 6379-6388 (2005).
- Xie, Z., Huganir, R. L., Penzes, P. Activity-dependent dendritic spine structural plasticity is regulated by small GTPase Rap1 and its target AF-6. Neuron. 48, 605-618 (2005).
- Jones, K. A. Rapid modulation of spine morphology by the 5-HT2A serotonin receptor through kalirin-7 signaling. Proc Natl Acad Sci USA. 106, 19575-19580 (1957).
- Dunaevsky, A., Tashiro, A., Majewska, A., Mason, C., Yuste, R. Developmental regulation of spine motility in the mammalian central nervous system. Proc Natl Acad Sci USA. 96, 13438-13443 (1999).
- Lichtman, J. W., Conchello, J. A. Fluorescence microscopy. Nat Methods. 2, 910-919 (2005).
- Svoboda, K. Do spines and dendrites distribute dye evenly. Trends Neurosci. 27, 445-446 (2004).
