Генерация и маркировки костного мозга мышей-дендритных клеток с Qdot нанокристаллов для отслеживания исследований

1. Препарирование мышей бедра и голени и культуры клеток костного мозга Жертва 2 мыши СО 2 удушья и тщательно анализировать большеберцовые кости и бедра, не сокращая кости концами. Чистая кости из всех подключенных тканей с помощью папиросной бумаги. Будьте осторожны, чтобы не сломать кости. Стерилизовать кости путем погружения в 70% этаноле в течение 10 мин в 35 мм чашки Петри. С этого момента работа внутри капота биобезопасности, чтобы избежать загрязнения клеточных культур. Восстановление кости из этанола и позволить им высохнуть на воздухе в течение 5 минут в чашке Петри внутри шкафа биобезопасности. Вырезать бедра в два раза, и голени его тонкий кончик. Настаивать внутри кости с 1 мл среды RPMI (без сыворотки, но с антибиотиками) с помощью стерильного шприца на стерильную чашку Петри. Клеточной суспензии собираются и промывают 2 раза в среде RPMI на 10 мин центрифугирования в центрифуге 15 трубки мл при 1100 оборотов в охлажденном центрифуги (4 ° С), размахивая ведром ротора. После последней стирки, ресуспендирования клеток в 2 мл буфера для лизиса ACK, инкубировать 5 минут при комнатной температуре в целях устранения красных кровяных телец. Добавить 13 мл RPMI с 10% FBS, ресуспендирования и мыть 2 раза в этой среде с теми же настройками, как описано в 1.6. Граф клеток, приспособиться к 2 х 10 5 клеток / мл RPMI 10% FBS, а также добавить RM-GM-CSF (20 нг / мл, конечная концентрация) 5. Добавьте 10 мл этой суспензии в стерильной, микробиологического качества, 10 см, чашка Петри, и культуры в CO 2 инкубаторе (37 ° C, 5% СО 2). Три дня спустя, добавьте еще 10 мл RPMI 10% FBS с 20 нг / л rmGM-КСФ на каждом из подготовленных пластин. Через три дня 10 мл клеточной суспензии взыскиваются с каждой чашке Петри, центрифугируют, как в 1.6, ресуспендировали в том же объеме RPMI 10% FBS с rmGM-CSF и вернулся в чашке Петри. Клетки культивировали в течение 2 дополнительных дней в CO 2 инкубаторе. 2. Сбор и маркировка РС Через 8 дней в культуре слабо прилипшие клетки восстанавливаются промывкой чашки Петри со свежей средой. Этот протокол предоставляет около 2-4 x10 8 контроллеров домена в наших руках. Клетки могут быть проанализированы на фенотип DC с помощью проточной цитометрии. Сборник Затем клетки помечены Qtracker 655 Сотовые Маркировка Kit строго следуя инструкциям производителя. Мы получили отличные результаты маркировки мышиный мозг происхождения кости контроллеры домена с Qdots на 10 нМ концентрации. Чтобы достичь этого, аликвоты Qtracker клеточных компонентов Маркировка Kit и Б смешивают в равных объемах, инкубировали в течение 5 минут при комнатной температуре, и сразу же разбавленного 1 / 100 в свежую среду с вортексе в течение 30 сек Чтобы пятна 5 х 10 6 DC, смешайте 5 мкл каждого комплекта компонентов А и В в пробирку Эппендорфа и инкубировать 5 минут при комнатной температуре. Затем добавьте 1 мл RPMI инкубировать 10% FBS, и вихрь в течение 30 секунды. Добавить 0,5 мл клеточной суспензии, содержащей 5 x10 6 контроллеров домена, и инкубировать при температуре 37 ° С в течение 60 мин. Затем вымыть клетки 2X в RPMI 10% FBS (1100 RPM). Клетки могут быть ресуспендировали в RPMI для дальнейшего культуры или в ФБР для инъекций в экспериментальных мышей. 3. Оценка меченых DC Сотовые маркировки может быть оценена с помощью флуоресцентной микроскопии. Для этого каплю суспензии клеток добавляется в стекло микроскопа, покрытое стекло покровное, и оценивается с флуоресцентным микроскопом, принимая во внимание, что эти Qdots имеют излучения и спектров возбуждения 565nm и 405-525nm соответственно (рис. 3 ) На данный момент, меченые клетки могут быть использованы для введения животным или созревания могут быть вызваны путем инкубации этих клеток в течение 48 ч (37 ° C, 5 CO 2) в присутствии ЛПС (100 нг / мл) и ФНО-( 20 нг / мл). Флуоресцентная маркировка не зависит от постоянного созревания (рис. 4). 4. Представитель Результаты: При этом мы рассказали, как подготовить мышиный мозг происхождения кости контроллеры домена и как обозначил их с люминесцентными Qdots. Рис. 1 приведены процедура получения клетки, а на рис. 2 представлена ​​процедура оформления с Qdots. Как показано на рис. 3, почти все клетки помечены этой процедуры, и это не зависит от постоянного созревания при воспалительных факторов (рис. 4). Рис. 5 показывает, что Qdot окрашенных РС (Fig.5a) ведут себя подобно не-окрашенных клеток при лечении воспалительных коктейль. Оба клеточных препаратов аналогичным upregulate выражение костимуляторных молекул (рис. 5, б), а также производить одинаковое количество IL-6 (рис. 5) и оксида азота (рис. 5, г) при созревании раздражители. Это согласуется с previПодразделения опубликованы данные о том, что окрашивание Qdot не влияет на возможность постоянного превращаться в зрелые клетки способны вызвать иммунный ответ [6]. Эти клетки затем можно использовать для введения экспериментальным животным. Как показано на рис. 6, 2-х дней после внутривенного введения меченого контроллеры домена в мышей, мы были в состоянии обнаружить Qdot-окрашенных клеток в селезенке. Это также согласуется с ранее опубликованные данные, показывающие использование Qdot нанокристаллов для оценки миграции постоянного тока в естественных условиях [6] неинвазивной визуализации и проточной цитометрии. Рисунок 1. Блок-схема DC поколения из костного мозга. При этом мы изобразить процесс получения костномозгового происхождения постоянного тока. Оба большеберцовые кости и бедра расчленены и очистить от окружающих тканей. Кость советы сохранились и интерьер кости сбрасываются со средой. После устранения красных кровяных клеток, клеток костного мозга выращивают в течение 8 дней в присутствии GM-CSF, чтобы отличить их на РС. Рисунок 2. Блок-схема процедуры маркировки. Равные аликвоты Qtracker клеточных компонентов Маркировка Kit и B должны быть смешаны в трубке Эппендорф. Дендритные клетки собираются с 8-дневным костного мозга культур с ГМ-КСФ и смешивается с маркировки красителя в течение 60 минут при температуре 37С. Затем клетки промывают в средствах массовой информации по ликвидации избыточных частиц маркировки. Рисунок 3. Флуоресцентные микрофотографии ДК сразу после маркировки. Капля меченых клеток наносили на предметное стекло и покрывается покровным. Затем образцы были оценены в флуоресцентный микроскоп и изображения были приобретены в результате Micropublisher 5,0 Цифровой CCD цветная камера (Qimaging, графство Суррей, Британская Колумбия, Канада). Рисунок 4. Флуоресцентные микрофотографии ДК после 48 ч созревания в лабораторных условиях. Маркированный домена культивировали в течение 48 ч с LPS (100 нг / мл) и ФНО-α (20 нг / мл) на стеклах на СО 2 инкубатора (37 ° C, 5% СО 2). Затем образцы промывают PBS (5 мин, 2X), фиксированный с ацетоном (15 мин, 4 ° С) и контрастно с DAPI. Клетки были оценены в флуоресцентный микроскоп как указано выше. Рисунок 5. Биологическая активность Qdot окрашенных зрелых ДК. Маркированный домена созрел в пробирке, как выше, были проанализированы с помощью проточной цитометрии (А) и (Б). (А) Qdot-окрашенных клеток дают сильный сигнал в FL3 (PercP) канала. Затененные гистограммы: неокрашенных контроля. (B) Qdot окрашенных и неокрашенных домена были дополнительно окрашивали специфических антител против созревание маркеров CD86 и CD40, а изотипа управления. Клетки затем анализируются в цитометр FACSort потока (Becton Dickinson, San Jose, CA). Кроме того, ИЛ-6 (С) и оксида азота (NO) были определены в супернатантах зрелых Qdot окрашенных ДК и контроля. Уровни ИЛ-6 и оксида азота определяли с помощью ELISA анализа и анализа Грисса как мы уже ранее описанных 7, 8. Все данные показали, на этом рисунке является представителем двух или трех независимых экспериментов показывает аналогичные результаты. Данные были проанализированы с помощью дисперсионного анализа GraphPad программного обеспечения. Рисунок 6. Обнаружение меченых контроллеры расчлененный тканей. Маркированный зрелых РС (1×10 6 клеток) были внутривенно вводят в C57BL / 6 мышей. (А) Через два дня мышей умерщвляли и селезенки собраны, оснастки заморожены, встроенные в октябре, и 8 мкМ разделы подготовлены с использованием криостата. Затем образцы были зафиксированы с помощью ацетона (15 мин, 4 ° С) и контрастно с DAPI. Клетки были оценены в флуоресцентный микроскоп, как и выше рис 6а. 40х увеличением, рис 6б: 100X увеличение, рис. 6С, 400X увеличении.