树突状细胞摄取抗原和迁移对目前处理的T细胞抗原的免疫器官。 Qdot纳米晶体的标签提供了一个长期和稳定的的荧光信号。这使得跟踪树突状细胞的荧光显微镜的不同器官。
树突状细胞(DC)的专业抗原提呈细胞(APCs)在外围组织和免疫器官,如胸腺,骨髓,脾,淋巴结和Peyer氏斑 1-3发现。区议会目前在外围组织样本的有机体抗原的存在,他们采取了,过程,并在其表面主要组织相容性分子(MHC)的背景下出现在。然后,抗原加载DCS迁移到他们目前处理的抗原引发特异性免疫反应的T淋巴细胞的免疫器官。评估区议会的迁徙能力的方法之一是标签与荧光染料 4 。
我们特此证明Qdot荧光纳米晶体的使用标签小鼠骨髓来源的DC。这种标签的优点是,Qdot纳米晶体具有稳定和持久的荧光检测标记细胞,恢复组织,使他们的理想。而要做到这一点,第一个细胞将恢复从小鼠骨髓培养8天粒细胞巨噬细胞集落刺激因子的存在,以诱导DC分化。这些细胞就会然后用荧光Qdots标记,在体外孵化。用荧光显微镜,可以可视化染色细胞。细胞可注入实验动物,在这一点上,或可以成为成熟的细胞在体外孵化后炎症刺激。在我们手中,DC的成熟并没有确定的荧光信号的损失也不Qdot染色影响区议会的生物学特性。注射后,这些细胞可以通过荧光显微镜下面的典型解剖和固定程序,免疫器官。
小鼠髓系)区议会已被广泛应用于以DC为基础的疫苗,以确定疗效和改善;调查DC:T细胞相互作用或DC发展; 在 9-11各种疾病,并确定它们的作用。现将我们展示了如何从从胫骨和股骨的骨髓恢复的前兆生成区议会。我们的骨头,没有切割提示恢复,使我们能够消毒浸没在乙醇70%,从而减少污染的可能性。为了从骨髓细胞分化议会,我们只用了 5先前所描述的GM – CSF的。尽管有些协议还使用IL – 4,据报道,这种因子是与GM – CSF的水平高12的工作时,没有必要。事实上,我们先前已经表明,这些区议会能诱导免疫反应 13 。此外,应采取恢复为期8天的文化的洗涤培养基的培养皿中,只是笼统地贴壁细胞,因为贴壁细胞表现出更多的类似单核细胞表型。在这里,我们展示区议会与荧光Qdot颗粒标签。这种标签有一些优势,尊重其他方法。首先,Qdots颗粒细胞很容易被纳入。二,荧光信号是非常高的,不是由DC的成熟而改变。三,荧光的细胞或组织固定溶剂,如丙酮,相反会发生什么,如果GFP是用来标记 14区议会,给予更多的时刻选择染色协议的灵活性时不会丢失。最后,尽管这些粒子的高荧光信号允许组织自体荧光的细胞可视化。如前所述6,Qdot染色并不影响这些细胞的成熟能力。现将我们Qdot染色DCS的行为在非染DCS类似的方式,上调共刺激分子,IL – 6和一氧化氮在炎症刺激生产。虽然区议会专门触发免疫反应的细胞,它们已被证明参与在病理条件下,如癌症和动脉粥样硬化4,15,16 。他们还声称,参与血管生成过程中甚至建议为参与结构,在发展的新船19,20 17,18 ,。因此,允许直流跟踪体内,并确定他们在不同的组织4,21的地域本地化的方法 ,22个是非常有价值的。
The authors have nothing to disclose.
这项工作由美国国立卫生研究院的支持下批准R15 CA137499 – 01(FB)和来自俄亥俄州立大学(FB)的启动资金的一部分。
Name of the reagent | Company | Catalogue number | Comments (optional) |
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C57BL/6 mice | Jackson laboratories | Females, 6-8 weeks old | |
RPMI | Invitrogen | 11875-119 | |
Fetal bovine serum, qualified | Invitrogen | 10437-028 | |
Antibiotic-antimycotic | Invitrogen | 15240-096 | |
PBS | Invitrogen | 10010-049 | |
ACK Lysing Buffer | Lonza Walkersville, Inc | 10-548E | |
Recombinant murine GM-CSF | PeproTech Inc | 315-03 | |
Qtracker 655 Cell Labeling Kit | Invitrogen | Q25021MP | |
Lipopolysaccharide | Invivogen | tlrl-eblps | |
Recombinant murine TNF alpha | Peprotech | 315-01A | |
CD86 antibody | BD Biosciences | 553691 | |
CD40 antibody | BD Biosciences | 553791 | |
Griess reagent system | Promega | G2930 | |
IL-6 capture antibody | eBioscience | 13-7061-81 | |
IL-6 detection antibody | eBioscience | 13-7062-81 |