我们描述一个Flippase引起的交互联系Gal80/Gal4镇压(FINGR)方法,允许组织特异性FLP确定Gal80表达模式。无论GAL4和FLP重叠,Gal4的表达是开启(Gal80翻转出)或关闭(Gal80翻转)。 FINGR方法是多才多艺的克隆分析和神经回路映射。
GAL4 / UAS二进制方法是强大的基因和果蝇的神经回路操纵。然而,对于大多数的神经生物学研究,Gal4的表达是很少的组织特异性,足以让行为读数电路精确相关。为了克服这一主要障碍,我们最近开发的FINGR方法,以达到更严格的Gal4的利益的组织中的表达。 FINGR方法有三个组成部分:1)传统Gal4/UAS系统; 2)FLP / FRT -介导Gal80转换工具; 3)增强子陷阱FLP(ET – FLP)。 GAL4是用来定义主利益的神经电路。果与Gal4的一个UAS的效应,如无人机MJD78Q或UAS石TS,调节神经元的活动,又表现在飞行行为的改变。 UAS – GFP,涉及具体行为的神经回路,如额外的无人机,记者可以同时映射形态分析。 Gal4的广泛表达线,Gal4的表达,可以限制使用两个互补Gal80转换工具: 浴缸P> Gal80>(“翻转”)和浴缸P <停止> Gal80(“翻转”) 。最后,调查人员可以把Gal80上或关闭,分别与具体组织ET – FLP的帮助。在翻盖模式,Gal80压制Gal4的表达无论GAL4和ET – FLP相交。在翻转式的模式,Gal80将缓解Gal4的镇压GAL4和FLP重叠细胞。这两种方法都使GAL4定义电路中的细胞数量的限制,但在一个反模式。 FINGR方法,是与广大Gal4的线在飞社区和高度传统的克隆分析和神经回路映射多功能集合兼容。在这个协议中,我们展示了FLP表达模式的选择,ET – FLPx2线中的感光细胞FINGR方法的有效性的映射。 FINGR方法的原则也应该适用于其他遗传模型Gal4/UAS,Gal80,FLP /首次登记税是用来生物。
Gal4/UAS系统已被广泛和成功地用于各种生物研究Drosophilists(Perrimon和品牌,1993年,达菲,2002年)。迄今为止,飞行社会产生了数以千计的启动子驱动和增强子陷阱Gal4的线。一个FINGR方法的主要优势在于,它是与Gal4/UAS系统兼容,从而有可能显着扩大在果蝇研究的Gal4的电源。
FINGR方法的一个重要的应用是微调,通过Gal4/Gal80交叉口的基本行为的神经回路。这些行为包括但不限于,学习和记忆,求偶,睡觉,和昼夜节律。 FINGR方法也可以用于地图,很容易在模拟人类神经退行性疾病如阿尔茨海默氏症,肌萎缩性脊髓侧索硬化症(ALS),和帕金森氏病神经退行性疾病的关键神经元。同样,神经细胞或神经回路调解可卡因,酒精和其他药物成瘾的关键灶可能映射使用FINGR方法。应该指出,有条件的Gal4s(奥斯特瓦德等人,2001年,罗马等,2001)可能是为了争取时间控制的神经回路和行为与FINGR方法。通过使用一个温度敏感的Gal80(Gal80 TS,麦奎尔等,2003)修改的Gal80转换工具,可以产生浴缸P>停止> Gal80 TS 或浴缸P> Gal80 TS>,加入进一步颞电路操纵的灵活性。除了神经系统,FINGR方法同样适用于限制Gal4的细胞亚群的表达,无论是左翼或腿。
ET – FLPx2线将首次登记税/ FLP基于克隆分析(徐鲁宾,1993年),包括MARCM(李洛,1999)感兴趣的所有果蝇生物学家的一个宝贵的资源。还预计一些ET – FLPx2行可能取代heatshock – FLP,生产重现性克隆和反复的形态和行为分析。增强子陷阱Gal4的线一样,大多数的ET – FLPx2线是不可能的,特别要表达的细胞在人的利益。大多数行会表达利益以及其他细胞或组织细胞和FLP。然而,缺乏“组织特异性GAL4和ET – FLPx2不会FINGR方法的一个主要关注,只要其重叠的区域是一个特定的实验需要。 FINGR的设计变成精致的两个“广义”的系统。
在这些协议中说明的方法,而标准和应重现。要求人的注意力主要警示步骤固定液的选择和使用。其他定影液,比煤灰,应避免,因为他们将淬火GFP信号。我们也注意到,解剖盘,应该不会有PFA固定使用,以避免工党表达不可靠绿色荧光蛋白报告的可能性。
The authors have nothing to disclose.
我们感谢来自俄克拉荷马大学(BZ)和美国国家科学基金会赠款(IOS – 1025556,BZ和RAB)的一个内部资金,用于支持成绩单,RAB的,XP中,氧化铝,MLW,中科院,而这项研究。美国国立卫生研究院资助(RO1 NS060878,以BZ)部分支持的RAB。 RAB的承认为支持这项研究的初期阶段的美国国立卫生研究院(T32 NS07292)印度国家遥感局授予布兰代斯大学的培训资助,以及美国国立卫生研究院资助(RO1 GM21473)授予杰弗里馆,布兰代斯。我们感谢他为这个项目的持续鼓励杰弗里厅。我们感谢为我们提供与浴缸P> Gal80>应变克里斯汀斯科特博士。