JoVE Journal > Neuroscience
Summary
Abstract
Protocol
Discussion
Disclosures
Acknowledgements
References
עברית

Automatically Generated
Please note that all translations are automatically generated. Click here for the English version.
Neuroscience

מיפוי יישומים הביטוי Flippase Enhancer-מלכודת הזחל וגם למבוגרים תסיסנית CNS

Published: June 03, 2011
doi:
10.3791/2649
, , , , , , , ,
1Department of Zoology,University of Oklahoma – Norman, 2Department of Biology,Brandeis University

Summary

אנו מתארים Flippase-Induced intersectional Gal80/Gal4 (FINGR) שיטת הדיכוי, המאפשר רקמות ספציפיות FLP לקבוע Gal80 דפוסי הביטוי. בכל מקום Gal4 חפיפה FLP, Gal4 הביטוי מופעלת (Gal80 התהפך החוצה) או לבטל (Gal80 התהפך ב). השיטה FINGR הוא תכליתי לניתוח המשובטים ומיפוי במעגל העצבי.

Abstract

השיטה Gal4 / כטב"מ בינארית היא חזקה עבור גנים מניפולציה המעגלים העצביים ב תסיסנית. עבור מחקרים הנוירוביולוגי ביותר, לעומת זאת, Gal4 ביטוי רק לעתים נדירות רקמות ספציפיות מספיק כדי לאפשר התאמה מדויקת של המעגל עם readouts התנהגותיות. כדי להתגבר על משוכה גדולה, אנחנו לאחרונה פיתח את שיטת FINGR להשיג מגבילים יותר Gal4 ביטוי ברקמות של עניין. השיטה FINGR יש שלושה מרכיבים: 1) מערכת Gal4/UAS המסורתית; 2) קבוצה של FLP / FRT בתיווך Gal80 כלים להמרת: 3), משפר מלכודת FLP (ET-FLP). Gal4 משמש כדי להגדיר את המעגלים העצביים העיקריים של עניין. קילוף Gal4 עם כטב"מ, מפעיל, כגון כטב"מ-MJD78Q או כטב"מ ש.י. ts, מווסת את הפעילות העצבית, אשר בתורו לידי ביטוי על ידי שינויים בהתנהגות לעוף. עם תוספת כטב"מ-הכתב כמו כטב"מ-GFP, המעגל העצבי מעורב בהתנהגות ספציפית ניתן למפות במקביל לניתוח מורפולוגי. עבור Gal4 שורות עם ביטוי רחב, Gal4 הביטוי ניתן להגביל על ידי שימוש בשני משלים Gal80-המרת כלים: גיגית P> Gal80> ("להעיף החוצה") ו גיגית P> לעצור> Gal80 ("להעיף ב '). לבסוף, החוקרים יכולים לפנות Gal80 או לבטל, בהתאמה, עם עזרה של רקמות ספציפיות ET-FLP. ב להעיף במצב, Gal80 יהיה להדחיק Gal4 ביטוי בכל מקום Gal4 ו ET-FLP מצטלבים. במצב להעיף החוצה, Gal80 ישחרר Gal4 דיכוי התאים בהם חפיפה Gal4 ו FLP. שתי הגישות לאפשר הגבלה של מספר תאים המעגלים Gal4 מוגדרים, אלא דפוס הפוך. השיטה FINGR תואם את האוסף העצום של Gal4 קווי בקהילה לעוף תכליתי מאוד לניתוח המשובטים המסורתי למיפוי מעגלים עצביים. בפרוטוקול זה, אנו מדגימים את מיפוי דפוסי FLP ביטוי לבחור ET-FLPx2 קווים את האפקטיביות של השיטה FINGR בתאים photoreceptor. העיקרון של השיטה FINGR צריך גם לחול על אורגניזמים אחרים מודל גנטי בו Gal4/UAS, Gal80, FLP ו / FRT משמשים.

Protocol

1. תסיסנית זנים Gal4 הנהג: GMR-Gal4, המבטא Gal4 בתאים photoreceptor. כטב"מ קווי כטב"מ-MJD78Q (או כטב"מ-polyQ), הגורמת ניוון עצביים Gal4-להביע את התאים. כטב"מ-GFP, המבטא GFP Gal4 ב-להביע תאים. FLP קווי אי-FLP, המבטא FLP ב photoreceptors ועל תתי קבוצות של אזורים במוח. ET-FLPx2 קווי, אשר משפר, מלכודת קווי המכיל שני עותקים של FLP (FLP-IRES-FLP). יש לנו שנוצר ~ 1000 ET-FLP קווי (בוהם et al. 2010), שאת הביטוי דפוסי הם עדיין לא מאופיין. כאן, אנו מתארים את האפיון של דפוס הביטוי של ET-FLPx2 לבחור במערכת הזחל והמבוגר לטוס העצבים המרכזית (CNS). FLP כתב י.ו., אקטין P> CD2> Gal4; כטב"מ-GFP (Pignoni & Zipursky, 1997), אשר דוחות את דפוס הביטוי של ET-FLPx2 דרך אקטין P> Gal4; כטב"מ-GFP על כריתה FLP בתיווך recombinational של> CD2. שני משלים Gal80-המרת כלים אמבטיה P> Gal80> (Gordon & Scott, 2009), לבנות להעיף החוצה, אשר מבטאת constitutively Gal80 בכל רקמות מונע על ידי מקדם טובולין חזק. עם רקומבינציה FLP בתיווך,> Gal80 מתהפך החוצה Gal80 הביטוי מסתיימת רק ב ET-FLPx2-לבטא רקמות. אמבטיה P> לעצור> Gal80 (בוהם et al. 2010), להעיף-in לבנות, אשר אינה מבטאת Gal80 בתנאים רגילים. Gal80 הביטוי מופעלת על ידי האמרגן טובולין רק ET-FLPx2-להביע את הרקמות בהן FLP מעיף החוצה להפסיק> ומדליקה ב Gal80. זבובים לבדיקת פעילות FLP בעין מתחם GMR-Gal4, כטב"מ-polyQ; גיגית P> לעצור> Gal80 (בוהם et al, 2010.), אשר מנוונת ועיניים depigmented. ב FLP-לבטא בתאי photoreceptor, הביטוי polyQ כבוי הבאים Gal80 להעיף ב. GMR-Gal4, כטב"מ-polyQ; (. בוהם et al, 2010) גיגית P> Gal80>, שיש לו עיניים רגיל. ב FLP-לבטא בתאי photoreceptor, הביטוי polyQ מופעלת הבאים Gal80 להעיף החוצה. 2. ריאגנטים פוספט שנאגרו מלוחים (PBS, 1X), pH 7.4. Paraformaldehyde 4% (PFA), בדילול מלא PBS מ -16% PFA, EM כיתה (Cat # 15710, מדעי מיקרוסקופיה אלקטרונית, הטפילד, PA) PBT, 1XPBS המכיל 0.1% Triton X-100 (Sigma) Anti-Elav (מב, 9F8A9; התפתחותית מחקרים Hybridoma בנק, אוניברסיטת איווה), כתמים כל הנוירונים תסיסנית. Anti-Repo (MAB 8D12; התפתחותית מחקרים Hybridoma בנק, אוניברסיטת איווה) כתמים ותאי גלייה ב תסיסנית. אלקסה 594 עוף נגד נוגדן עכבר משני (Invitrogen) 3. מיפוי דפוס הביטוי של משפר-מלכודת קווי FLPx2 (* השלבים הקריטיים) איסוף הנקבות הבתולות מ י.ו., אקטין P> CD2> Gal4; כטב"מ-GFP קו חוצה לגברים של ET-FLPx2 קווים בודדים. לשעבר משמש ככתב GFP לביטוי רקמה של ET-FLP. * מנתחים נדודים 3 rd הזחלים instar F1, לשמור על מערכת העצבים המרכזית (קרי, את המוח ואת חוט העצב הגחון, VNC) לבין הקיר הגוף, לתקן במשך שעה 1 ב PFA 4% על הקרח, לשטוף עם 3X קר כקרח PBS ואחריו שוטף 3X עם PBT. בתור הסר נדודים 3 rd הזחלים instar F1 ולמקם אותם לתוך צלחת Sylgard נקי (35 מ"מ x 10 מ"מ צלחת פטרי מלאות 2 גרם Sylgard – מעורב על פי הוראות לייצור). הסר פסולת מזון עם מכחול מלאו את המנה עם קרים כקרח 1XPBS ומניחים על קרח כדי להרדים את הזחלים החזק את ווים הפה של הזחל עם זוג מלקחיים לתפוס את לציפורן ליד spiracle הקדמי הארכת עם זוג נוסף של מלקחיים וקליפת לציפורן לקראת סוף האחורי. CNS יצורף הפה ווים יחד עם בלוטות הרוק, המעיים, ואת הדיסקים דמותי. הסרת רקמה עודפת ודיסקים דמותי המקיפים את מערכת העצבים המרכזית. מעבירים את מערכת העצבים המרכזית אל צלחת PBS מלא 3 פיירקס היטב. טיפ siliconized P200 פיפטה יכול לשמש כדי למנוע התייבשות הרקמה. תקן שעה 1 ב 200 μl של PFA 4% על הקרח. ודא כי מערכת העצבים המרכזית הוא שקוע לחלוטין בתוך PFA. אם מערכת העצבים המרכזית צף, זה בדרך כלל מצביע על כך CNS לא ניקו כראוי מן הרקמה הסובבת. לשטוף עם 3X קר כקרח PBS ואחריו שוטף 3X עם PBT. * מנתחים את מערכת העצבים המרכזית של זבובים בוגרים F1. הרדימי הזבובים עם CO 2 או במקום זבובים הכלול בתוך צנצנת ריקה על קרח במשך 10 דקות. בוגר המקום זבובים לצלוחית EtOH מלא 95% זכוכית על קרח למשך 30 שניות. העברת הזבובים הבוגרים לתוך 1XPBS מלא צלחת זכוכית על הקרח. לשטוף עם 3X קר כקרח 1X PBS להסיר EtOH שיורית מניחים לעוף לתוך Sylga 35mmצלחת rd מלאים קר כקרח 1X PBS הנח את הצד הגחוני פונה כלפי מעלה והכנס עט חרקים קטנים (סיכות minutiens 0.1 מ"מ) באמצע דרך הבטן. בעזרת זוג מלקחיים להחזיק את הבסיס של הרגליים ולהסיר את הרגליים עם זוג נוסף של מלקחיים. הסר את ראש לציפורן בעוד לתפוס את חוטם עם זוג אחד של מלקחיים, במקום אחר מתחת לעין וקליפת לציפורן לעבר קו אמצע הגב של ראש לעוף. תפוס את העין השנייה ולהסיר את לציפורן הנותרים בצד השני. בעזרת מלקחיים חדות ו / או מחט טונגסטן חידד, להסיר רקמות קנה הנשימה המקיפים את המוח ניקוי נכון של קנה הנשימה תגרום חזק פלואורסצנציה אוטומטי, שיבוש הביטוי GFP, ולאפשר למוח לצוף במהלך תיקון VNC Dissection הסר את לציפורן החזי החל בסוף האחורי של בית החזה, למקם שני מלקחיים בכל צד של preepisternum ה -3 (כלומר, לתפוס את הבסיס של הרגליים האחוריות). בעדינות להפריד בין לציפורן הרחק מקו קו האמצע הגחון, לחזור על זה עד שתגיע בסיס הצוואר. בעדינות להפיץ את שני חצאי לציפורן החזי חשיפת VNC הבא להסיר את הבטן מהחזה. בעוד בעזרת זוג מלקחיים להחזיק את החזה בבסיס הרגל השנייה, השתמש עוד זוג מלקחיים לתפוס את הבטן ליד 1 sternite בטן למשוך את הבטן. כדי להסיר את VNC מרקמות החזי שמסביב. החזק את אזור humeral עם זוג מלקחיים עם זוג נוסף של מלקחיים דמעה עדין משם את רוב הפגר החזי. בשלב זה צריך להיות צלצול של רקמת חיבור המקיפה את החיבור צוואר הרחם (צוואר). השימוש בשתי מלקחיים לקרוע את הטבעת בנפרד. הסר את כל רקמת החזה עודף סביב VNC מעבירים את המוח עד 9-VNC גם צלחת פיירקס המכיל 1X PBS על הקרח טיפ siliconized P200 פיפטה יכול לשמש כדי למנוע התייבשות הרקמה * לתקן את מערכת העצבים המרכזית הבוגרת במשך שעה 1 ב PFA 4% על הקרח ולשטוף 3X עם קרים כקרח PBS ו 3X עם PBT. דגירה הכנת CNS מבוגר או CNS הזחל קיר הגוף על 4 מעלות צלזיוס לילה עם נוגדנים או נוירונים (אנטי Elav, 01:10) או גליה (anti-Repo. 01:10). שטפו את הכנת 5X עם PBT. דגירה עם הכנה מבוגר או הזחל עם עוף 594 אלקסה נגד נוגדן עכבר משני (1:100) בטמפרטורת החדר למשך 2 שעות, ולשטוף את הכנת עם PBS. הר CNS הזחל או הבוגר בשקופית. כדי לשמר את צורתו הטבעית של מערכת העצבים המרכזית, להשתמש טבעת O דמוי פלסטיק (לייבל חיזוק נקה, אייברי דניסון, מוצרי משרד, ברי, CA) בשקופית כגשר מיני להשעות את תלוש לכסות. בחנו את דפוסי הכנה GFP ו Elav (או Repo) ביטוי תחת מיקרוסקופ פלואורסצנטי. 4. היישום של שני Gal80-המרת כלים משלימים דיכוי Gal4 ב photoreceptors היפוך Gal80 החוצה דרך גיגית P> Gal80> (איור 5 א). איסוף הזכרים מן GMR-Gal4, כטב"מ-polyQ; גיגית P> Gal80 קו>. שים לב, עיניים מורכבות הן נורמליות אצל זבובי אלה. מטה עם אי-FLP בתולות. איסוף הזבובים F1 ולבחון את הפנוטיפ עיניים. היפוך Gal80 באמבטיה דרך P> לעצור> Gal80 (איור 5 ב). איסוף GMR-Gal4, כטב"מ-polyQ; גיגית P> לעצור> Gal80 זבובים זכרים לבחון את הפנוטיפ עיניים. שים לב מנוונת ועיניים depigmented אצל זבובי אלה לעומת זנים סוג בר (קנטון-S) מטה עם אי-FLP בתולות; איסוף הזבובים F1 ולבחון את הפנוטיפ עיניים. בחר ET-FLPx2 שורות עם ביטוי בתאים photoreceptor צעדים 4.1 ו 4.2 ניתן לחזור שימוש ET-FLPx2 קווים המבטאים FLP משנה של התאים קולטי האור. לחלופין, גם את GMR-Gal4, כטב"מ-polyQ; גיגית P> לעצור> Gal80 זבובים או GMR-Gal4, כטב"מ-polyQ; גיגית P> Gal80> זבובים ניתן חצה את ET-FLPx2 קווים בודדים המסך קווים המבטאים FLP בתאים photoreceptor. המוערכים ET-FLPx2 הקווים הם אלה רק להביע FLP ב משנה או תאים photoreceptor יחיד (איור 6). 5. נציג תוצאות דפוס הביטוי של קו ET-FLPx2 ספציפי ניתן לבדוק בקלות מתועד הזחלים F1 או מבוגר זבובים שמקורם לעבור בין י.ו., אקטין P> CD2> Gal4; כטב"מ-GFP בתולות ET-FLPx2 זכרים (איור 1) . בדרך כלל, 3-5 משכפל החיות F1 הם ניתח ובחן כדי לקבוע את שחזור של דפוס הביטוי FLP (בוהם et al. 2010). <strong> איור 2 מציג את דפוס הביטוי של FLP ב 173A FLPx2 ET-line ב CNS הזחל לבין הבוגר. דפוס FLP ניתן לנתח נוסף באמצעות סמן עצבי או גליה (איור 3 & 4). התוצאות באיור 7 להדגים את האפקטיביות של Gal80 להעיף פנימה להעיף החוצה מערכות הדיכוי intersectional של רקומבינציה Gal4 FLP בתיווך הבאה. גיגית P> לעצור> Gal80 לבנות לא נראה לי כל ביטוי של דולף Gal80 (מבוסס על לניוון depigmentation אחיד של קולטני האור), ובכל זאת הוא 100% יעיל מרפרף Gal80 ב בעזרת eyFLP להדחיק-GMR Gal4 ולשחזר את עין הופעות רגילה (איור 7 א). להיפך, גיגית P> Gal80> מלא מדכא GMR-Gal4 לפני כניסתה של eyFLP. בעקבות Gal80 להעיף החוצה, GMR-Gal4 כוננים כטב"מ-polyQ הביטוי, המוביל מנוונת ועיניים depigmented (איור 7 ב). בדוגמה זו, השתמשנו FLP הפאן photorecetor למפות "מעגלים" photoreceptor אבל לא לבחון את השלכות התנהגותיות. בעזרת גישות דומות עם Gal4 הקווים הרלוונטיים התנהגותית, אנו ממופה לחלק של המעגל, Gal4 CCAP ויסות הרחבה הזרוע אצל זבובי מבוגר (בוהם et al. 2010). אנו מאמינים כי שיטת FINGR יהיה יקר בסיוע להבנת הבסיס העצבי של התנהגות. באיור 1. . בחינת דפוס הביטוי של קו ET-FLPx2 דפוס הביטוי FLP (אליפסות כחול) מקו ET-FLPx2 ניתן לקבוע על ידי מעבר ET-FLPx2 הגברי (למעלה משמאל) עם אקטין P> CD2> Gal4; כטב"מ- GFP בתולה (מימין למעלה). Ubiquitous אקטין P> Gal4 ביטוי הנקבה ההורים מתעכבת על ידי החדרה של רצף (משולשים אפור) FRT CD2 מוקף. ב צאצאים F1, FLP יהיה הבלו רצף CD2, המתיר אקטין P> Gal4 לנהוג כטב"מ-GFP הביטוי. איור 2. דפוס הביטוי של קו ET-FLPx2 במערכת הזחל למבוגרים העצבים המרכזית. תמונות אלה מתארים את מערכת העצבים המרכזית (המוח הגחוני חוט העצב, VNC) גזור מן הצאצאים המופק ההזדווגות י.ו., אקטין P> CD2> Gal4; כטב"מ-GFP ההורים לקו ET-173A FLPx2. על ידי recombining את קלטת> CD2>, FLP מפעיל אקטין P> GAL4 הביטוי (הביטוי הסוגר של כטב"מים-GFP). לפיכך, דפוס GFP דוחות FLP-להביע תאים. לוח מראה את דפוס הזחל ביטוי FLP בעוד פאנל B מציג את דפוס הביטוי הבוגרת 173A קו. איור 3. אפיון של סוגי תאים המבטאים flippase בקו FLPx2 ET-688A #., דמות מורכב של הזחל קבוע F1 3 rd instar מוכתם אנטי ריפו מן הכלאה בין קו FLPx2 ET-688A # וקו Flippase GFP הדיווח. BD, הגדלה גבוהה (Plan-Zeiss Apochromat 63x נפט) נוף שנלקחו סוף האחורי של VNC מתוך הזחלים instar 3 rd. איור 4. אפיון של סוגי תאים בתוך הגוף פטריות הקו FLPx2 ET-150 #. AC, דמות הגדלה גבוהה (63x טבילה שמן) של הגוף מפני פטריות הזחל קבוע F1 instar 3 מוכתם אנטי ריפו. איור 5. איור של Gal80 אסטרטגיות Flip-in Flip-out. א באסטרטגיה להעיף החוצה, טובולין האמרגן מונחה Gal80 (אמבטיה P> Gal80>) הוא פעיל constitutively, וכתוצאה מכך לדיכוי של GMR-Gal4 ו פנוטיפ wild-type העין (עין אדומה). דיכוי זה הוסר על ידי הקדמה של FLP (סגול), אשר Gal80 להעיף החוצה (באמצע, אדום) ו-GMR מאפשרת Gal4 לנהוג כטב"מ-polyQ הביטוי. התוצאה היא התנוונות התאים קולטי האור (מאויר על ידי נקודות לבנות בעין). B. ב הגומלין של האסטרטגיה הקודמת, האמרגן מונחה טובולין Gal80 ביטוי מופרעת על ידי FRT (אפור משולש) ולצדו קודון "עצור". בהעדר Gal80, GMR-Gal4 נקשר כטב"מ-polyQ גורמת להתנוונות העצבית photoreceptors (מאויר על ידי נקודות לבנות בעין). על ידי מעבר-GMR Gal4, כטב"מ-polyQ; גיגית P> לעצור> GAL80 זכרים עם נקבות בתולה המבטאים FLP בתאים photoreceptor, FLP (סגול) יהיה לזרז רקומבינציה באתרי FRT, מוציא את "לעצור" קודון (באמצע, אדום), ובכך מאפשר ביטוי Gal80 ודיכוי של GMR-Gal4. זו שומרת על ניוון מוחיים בתאים photoreceptor (מאויר על ידי חוסר wנקודות הייט בעין). איור 6. היישום של השיטה FINGR ב מרפרף Gal80 החוצה באמצעות ET-FLPx2 קו # 688A צאצאים F1 של הכלאה בין קו FLPx2 ET-688A # בתולה GMR-Gal4, כטב"מ-polyQ;. TubP> GAL80 זכר. חוסר פיגמנט באמצע האומטידיה העין מייצג ביטוי FLP בקו # 688A. באזור זה Gal80 דיכוי-GMR Gal4 הוקל המאפשר Gal4 לנהוג כטב"מ-polyQ. איור 7. היישום של השיטה FINGR ב מרפרף Gal80 פנימה או החוצה כדי לחתוך Gal4 ב photoreceptors. א גיגית P> לעצור> Gal80 להעיף במערכת מגבילה GAL4 ביטוי באופן FLP תלויי. ב-GMR Gal4, כטב"מ-polyQ; גיגית P> לעצור> GAL80 זבובים, הם תאים photoreceptor מנוון depigmented (לטוס משמאל). בעקבות כניסתה של eyFLP, Gal80 מתבטא בתאים photoreceptor, והתוצאה היא דיכוי מלא של GMR-Gal4, אשר בתורו מכבה את polyQ ביטוי ומייצרת זבובים עם עיניים רגיל (לעוף מימין). B. גיגית P> Gal80> להעיף הקצוב המערכת פועלת בצורה הפוכה כמו באמבטיה P> לעצור> Gal80 להעיף במערכת. אמבטיה P> Gal80> constitutively GAL4 מדכא ומדכא את הביטוי של polyQ (משמאל לטוס, עם עיניים רגיל). בעקבות המבוא של eyFLP, Gal80 מתהפך החוצה מתאי photoreceptor, להקלה על דיכוי-GMR Gal4 והפעלת polyQ הביטוי. זה מוביל זבובים עם מנוון ועיניים depigmented (לעוף מימין).

Discussion

המערכת Gal4/UAS כבר בשימוש נרחב בהצלחה על ידי Drosophilists ללימודים ביולוגיים שונים (Brand & Perrimon, 1993; דאפי, 2002). עד כה, הקהילה לטוס יצרה אלפי האמרגן מונע משפר-מלכודת Gal4 הקווים. הכוח העיקרי של השיטה FINGR היא שזה תואמת למערכת Gal4/UAS, מה שהופך אותו ניתן להרחיב באופן משמעותי את כוחו של Gal4 ב תסיסנית מחקרים.

אחד היישומים החשובים של השיטה FINGR היא לכוונן מעגלים עצביים הבסיסית התנהגות דרך צומת Gal4/Gal80. התנהגויות אלה עשויות לכלול, אך אינם מוגבלים, למידה וזיכרון, חיזור, שינה, קצב היממה. השיטה FINGR יכול לשמש גם כדי למפות את הנוירונים קריטי נוטים ניוון מוחיים בדוגמנות מחלות ניווניות אנושיות כגון אלצהיימר, טרשת לרוחב amyotrophic (ALS), מחלות פרקינסון. כמו כן, מוקדים של נוירונים או מעגלים עצביים חיוני קוקאין מתווך, אלכוהול, התמכרות חומר אחר יכול להיות ממופה בשיטת FINGR. יצוין כי Gal4s מותנה (Osterwalder et al, 2001;.. הרומית et al, 2001) ניתן להשתמש בשיטת FINGR על מנת להשיג שליטה הזמני של מעגלים עצביים והתנהגויות. שינוי של Gal80-המרת כלים באמצעות טמפרטורה רגיש Gal80 (Gal80 ts, מקגווייר et al., 2003) יכול לייצר גיגית P> לעצור> Gal80 ts או באמבטיה P> Gal80 ts> והוסיף הגמישות הזמני נוספת מניפולציה מעגל. מעבר למערכת העצבים, שיטת FINGR ישים באותה מידה הגבלת Gal4 ביטוי תת קבוצות של תאים אם היא הזרוע או הרגל.

ET-FLPx2 הקווים יהיה משאב יקר ערך עבור כל ביולוגים תסיסנית מעוניין בניתוח FRT / FLP מבוססי המשובטים (שו & Rubin, 1993), כולל MARCM (Lee & Luo, 1999). צפוי גם כי חלק FLPx2-ET קווי עשוי להחליף heatshock-FLP לייצור שיבוטים לשעתקו עבור ניתוחים מורפולוגיים והתנהגותיים חוזרות ונשנות. כמו משפר-מלכודת Gal4 קווים, רוב ET-FLPx2 קווי צפויים לבוא לידי ביטוי באופן ספציפי בתאי עניין אחד. רוב קווי יביע FLP בתאים של ריבית בתאים או ברקמות אחרות. עם זאת, היעדר "סגוליות רקמה" של שניהם Gal4 ו ET-FLPx2 לא תהיה הדאגה העיקרית לשיטת FINGR עוד באזור שלהם חופפים רצוי ניסוי מסוים. FINGR נועד להפוך את שתי רחבה 'מערכות לאחת מעודן.

שיטות מאויר בפרוטוקולים אלה הם סטנדרטיים למדי, צריך להיות לשחזור. השלבים העיקריים אזהרה המחייבים תשומת לב של אדם הם הבחירה והשימוש מקבע. Fixatives אחר מאשר PFA יש להימנע כי הם להרוות את אות ה-GFP. רשמנו לפנינו גם את המנה לנתיחה לא אמור לשמש עבור קיבעון עם PFA, כדי למנוע את האפשרות כי הביטוי FLP לא יהיה דיווח מהימן על ידי ה-GFP.

Disclosures

The authors have nothing to disclose.

Acknowledgements

אנו מודים לקרן פנימית מאוניברסיטת אוקלהומה (ל BZ) וכן מענק NSF (IOS-1025556, ל RAB ו BZ) לתמיכה TRF, ראב, XP, AAO, MLW, CAS, וזה מחקר. מענק NIH (RO1 NS060878, כדי BZ) נתמך בחלקו ראב. RAB מודה NRSA NIH (T32 NS07292) אימון מענק הוענק אוניברסיטת ברנדייס, וכן מענק NIH (RO1 GM21473) הוענק ג'פרי הול באוניברסיטת ברנדייס, לתמיכה בשלבים המוקדמים של המחקר הזה. אנו מודים ג'פרי הול עידוד מתמשך שלו עבור פרויקט זה. אנו מודים לד"ר קריסטין סקוט לספק לנו באמבטיה P> Gal80 זן>.

References

  1. Bohm, R. A., Welch, W. P., Goodnight, L. K., Cox, L. W., Henry, L. G., Gunter, T. C., Bao, H., Zhang, B. A genetic mosaic approach for neural circuit mapping in Drosophila. Proc Natl Acad Sci U S A. 107, 16378-16383 (2010).
  2. Brand, A. H., Perrimon, N. Targeted gene expression as a means of altering cell fates and generating dominant phenotypes. Development. 118, 401-415 (1993).
  3. Bruno, B., Holbro, N., Reichert, H. Polycomb group genes are required for neural stem cell survival in postembryonic neurogenesis of Drosophila. Development. 134, 1091-1099 (2007).
  4. Duffy, J. B. GAL4 system in Drosophila: a fly geneticist’s Swiss army knife. Genesis. , 34-341 (2002).
  5. Gordon, M. D., Scott, K. Motor control in a Drosophila taste circuit. Neuron. 61, 373-384 (2009).
  6. Lee, T., Luo, L. Mosaic analysis with a repressible cell marker for studies of gene function in neuronal morphogenesis. Neuron. 22, 451-461 (1999).
  7. McGuire, S. E., Le, P. T., Osborn, A. J., Matsumoto, K., Davis, R. L. Spatiotemporal rescue of memory dysfunction in Drosophila. Science. 302, 1765-1768 (2003).
  8. Osterwalder, T., Yoon, K. S., White, B. H., Keshishian, H. A conditional tissue specific transgene expression system using inducible GAL4. Proc Natl Acad Sci USA. 98, 12596-12601 (2001).
  9. Pignoni, F., Zipursky, S. L. Induction of Drosophila eye development by decapentaplegic. Development. 124, 271-278 (1997).
  10. Roman, G., Endo, K., Zong, L., Davis, R. L. P[Switch], a system for spatial and temporal control of gene expression in Drosophila melanogaster. Proc Natl Acad Sci U S A. 98, 12602-12607 (2001).
  11. Xu, T., Rubin, G. M. Analysis of genetic mosaics in developing and adult Drosophila tissues. Development. 117, 1223-1237 (1993).

Tags

Gal4/UAS Binary MethodGene ManipulationNeural Circuitry ManipulationFINGR MethodGal4 ExpressionGal80 Converting ToolsEnhancer-trap FLPUAS-effectorUAS-reporterMorphological AnalysisTubP>Gal80> (‘flip Out’)TubP>stop>Gal80 (‘flip In’)

Play Video
PDF
DOI
Cite This Article
Fore, T. R., Ojwang, A. A., Warner, M. L., Peng, X., Bohm, R. A., Welch, W. P., Goodnight, L. K., Bao, H., Zhang, B. Mapping and Application of Enhancer-trap Flippase Expression in Larval and Adult Drosophila CNS. J. Vis. Exp. (52), e2649, doi:10.3791/2649 (2011).
Download Citation
Reprints and Permissions

View Video

✖

To prove you're not a robot, please enter the text in the image below

CAPTCHA Image
Play CAPTCHA Audio
Refresh Image