このビデオプロトコルは、神経コロニー形成細胞アッセイを用いて神経前駆細胞の混合集団で善意の神経幹細胞を区別して列挙する方法を示しています。
ニューロスアッセイ(NSA)は、分離拡大し、また、神経幹細胞(NSC)の周波数を計算するために最も頻繁に使用される方法の1つです。また、この無血清培養システムは、幹細胞を拡大し、腫瘍と正常組織のさまざまなから自分の周波数を決定するために採用されている。それは一対一の関係はニューロスフェアの形成とNSCの間に存在していないことが最近示されている。これはNSAとして現在適用されているが、胚と成体哺乳類の脳の両方から分離された神経前駆細胞の混合集団でNSCの頻度を過大評価することを示唆している。このビデオでは、実質的に半固形アッセイ、彼らの長期的な増殖能に基づいて、前駆細胞から幹細胞を識別する能力を持つニューラルコロニー形成細胞アッセイ(N -シミュレーションプロジェクト)を、考慮した、全く新しいコラーゲンを示し、そのための方法を提供するNSCの周波数を列挙する。コロニーが<2ミリメートルの前駆細胞から派生している間、N -シミュレーションプロジェクトでは、直径のコロニー≥2 mmを、NSCのすべての機能の基準を満たす細胞から派生しています。 N -シミュレーションプロジェクトの手順は、プライマリおよび培養成体または胎児マウスの中枢神経系の細胞を含むさまざまなソースから調製した細胞に使用することができます。ここでは、通路からN -シミュレーションプロジェクトを実行するために胚性14日目マウスの脳から生成されたニューロスフェアを準備セルを使用してください。培養は、播種した細胞がその完全な増殖能を示すことができるように、増殖培地で3週間、7日ごとに補充されていますし、神経前駆細胞と善意の神経幹細胞の頻度は、<2ミリメートルであるコロニーの数をカウントすることで、それぞれ計算されます。と≥2ミリメートルが最初に播種した細胞の数を参照しているもの。
ニューロスフェアの検定3,1,2は、大人と胚中枢神経系の組織のようなさまざまなソースからの神経幹細胞を分離し、拡大する最も一般的な方法ですが、それは正確に神経前駆細胞(幹細胞の混合集団でNSCの周波数を測定することができないとニューロスフェアの数と善意の幹細胞の数は4との間の一対一の対応関係がないとして前駆細胞)。この制限に対処するため、元NSAは、神経幹細胞および前駆細胞5-7三週間、完全な増殖能に成長させるように適応されています。半固体コラーゲンマトリックスは、コロニーのメッキと凝集単一細胞の遊走を妨げるとして液体NSAとは異なり、N -シミュレーションプロジェクトではコロニーは実際にクローン的、派生しています。このアッセイで一貫性のある結果を得るためにお勧め:
The authors have nothing to disclose.
この作品は、オーバストリート財団からの資金によってサポートされていました。
Material Name | Type | Company | Catalogue Number | Comment |
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NeuroCult NSC Basal Medium | Medium | STEMCELL | 05700 | |
NeuroCult NSC Proliferation Supplements | Medium supplement | STEMCELL | 05701 | |
NeuroCult NCFC medium | Medium | STEMCELL | 05720 | |
0.05% trypsin-EDTA | Reagent | Gibco | 25300-062 | |
Soybean trypsin inhibitor | Reagent | Sigma | T6522 | |
Cell strainer | Sieve | BD Falcon | 352340 | |
Pen/Strep | Reagent | Gibco | 15140-122 | |
T25 flask | Culture ware | Nalge Nunc international | 136196 | |
T80 flask | Culture ware | Nalge Nunc international | 178905 | |
Collagen | Reagent | STEMCELL | 04902 | |
EGF | Growth factor | R&D | 2028-EG | |
b-FGF | Growth factor | R&D | 3139-FB | |
Heparin | Growth factor | Sigma | H4784 | Reconstituted in PBS |
15 ml tubes | Culture ware | BD Falcon | 352096 | |
50 ml tubes | Culture ware | BD Falcon | 352070 | |
35 mm culture dishes | Culture ware | STEMCELL | 27100 | |
Gridded scoring dishes | Culture ware | STEMCELL | 27500 |