Neurale-Colony Forming Cell-test: Een test om Bona Fide neurale stamcellen van Neural Progenitor Cellen Discrimineer

1. Artikelen die moeten worden voorbereid voordat doorgaat to Cell Plating: Geschikt volume van complete NSC medium wordt bereid door het mengen van NeuroCult NSC basismedium en NeuroCult NSC proliferatieverdrag Supplementen op een 09:01 verhouding, respectievelijk. Een deel van het NeuroCult NCFC serum-vrij medium zonder Cytokines is ontdooid. Het medium wordt opgewarmd in een 37 ° C waterbad. Stock oplossingen van epidermale groeifactor (EGF), basic fibroblastische groeifactor (b-FGF), bij een concentratie van 10 ug / ml en heparine op 0,2% vooruit zijn voorbereid. Afhankelijk van de grootte van experiment, zijn verschillende 35mm weefselkweek gerechten die nodig zijn om het bord van de cellen en een 150-200cm plastic petrischaal is ook nodig om de dubbele 35mm gerechten te houden en een derde 35mm schotel voor water. 2. Cel Bereiding: Afhankelijk van uw experiment, kunnen cellen worden bereid uit een volwassene of embryonale bron (primaire gedissocieerde weefsel of gedissocieerd neurospheres). Ontleden weefsels van volwassen / embryonale muis centraal zenuwstelsel (CZS) of distantiëren volwassenen / embryonale-afgeleide neurospheres zoals eerder beschreven 1,2 en vervolgens: De enkele celsuspensie wordt door een 40-um-size mesh filter om zo niet-gesplitste klonten te verwijderen. 10μl van de celsuspensie wordt gemengd met 90μl van trypan blauw om een celgetal uit te voeren. Opmerking: Andere juiste cel verdunningen kunnen ook worden gebruikt. Bij gebruik van primaire embryonale of adulte afgeleide neurale cellen, verdunnen de celsuspensie om een concentratie van 6,5 x 10 5 cellen / ml in volledig NSC medium. Bij het ​​gebruik van cellen van los neurospheres afgeleid van volwassen of embryonale neurale cellen, verdunnen de celsuspensie om een concentratie van 2,2 x 10 5 cellen / ml in volledig NSC medium. 3. Plating Cellen in Semi-solid N-CFCA Medium: Het juiste volume van de volgende componenten wordt gemengd in orde is, afhankelijk van het aantal herhalingen. Hier hebben we mengen het bedrag dat nodig is voor twee replicaten of dupliceren gerechten. Voor extra nummers van herhalingen, zie tabel 1. 1,7 ml NeuroCult NCFC serum-vrij medium zonder Cytokines 330 pi van NeuroCult NSC Proliferatie Supplementen 6,6 pi van de EGF (10μg/mL) 32 pl van penicilline / streptomycine 3,3 pi van b-FGF (10μg/mL) alleen vereist als het kweken van cellen afkomstig van volwassen neurale cellen. 3,3 pi van heparine (0,2%) alleen vereist als het kweken van cellen afkomstig van volwassen neurale cellen. 25μL celsuspensie (van 2,2 x 10 5 cellen / ml cellen van gedissocieerd neurospheres of 6,5 x 10 5 cellen / ml primaire cellen van gedissocieerd CNS weefsel). Opmerking: De laatste vergulde aantal cellen moet ongeveer 2500 cellen per 35 mm cultuur schotel voor neurosphere afgeleide cellen en 7500 cellen per 35 mm cultuur schotel voor primaire cellen. In sommige gevallen, de laatste cel plating dichtheid moet worden aangepast door het uitvoeren van een cel titratie experiment. Voor statistische analyses, moet het totale aantal gedetecteerde kolonies na 21 dagen van de cultuur binnen het bereik van ten minste 50 tot 150 kolonies. Het medium dat de cellen is matig en vervolgens gemengd 1,3 ml koud Collageen oplossing is overgebracht naar de cel schorsing en goed gemengd met zachte pipetteren te voorkomen dat er eventuele luchtbellen. De gemengde oplossing is afgegeven voor het midden van elk 35mm cultuur schaal (~ 1,5 ml / gerecht) en de gerechten worden getipt zachtjes met een draaiende beweging te laten het mengsel verspreid gelijkmatig over het oppervlak van de schotel. . De dubbele 35 mm cultuur gerechten worden geplaatst in een 100 mm Petri plaat. Het deksel van de nieuwe 35 mm gerecht is verwijderd en de open schotel is ook geplaatst in dezelfde 100 mm petrischaal. Steriel water wordt toegevoegd aan deze open 35 mm schaal om een ​​optimale vochtigheidsgraad te behouden tijdens de incubatieperiode. Bioassay vierkante platen (245 mm) worden gebruikt wanneer meer repliceren 35 mm gerechten zijn opgezet. Nogmaals, onder 2 of 3 open 35 mm platen met steriel water. De platen worden overgebracht naar een incubator ingesteld op 37 ° C, 5% CO2 en 95% luchtvochtigheid. Het collageen stolt door het verhogen van de temperatuur en gelvorming zal plaatsvinden binnen ongeveer een uur. De culturen moeten niet gestoord worden tijdens deze periode. Gekweekte cellen worden geïncubeerd gedurende 21 dagen (verschillen in kolonie grootte kunnen duidelijk onderscheiden worden na 21 dagen). 4. Voorbereiden Replenishment Medium en voeden van de cultuur: Als N-CBVC culturen worden geïncubeerd voor een langere periode (21 dagen), moet culturen worden gevoed met de juiste volledige NeuroCult replenishment medium vers bereid als volgt: 4,5 ml NeuroCult NSC basismedium wordt gemengd met 0,5 mL van NeuroCult NSC Proliferatie Aanvullingen en dan de groeifactoren wordt toegevoegd: 250 ul van 10μg/mL EGF (tot een uiteindelijke concentratie van 0,5 ug / ml EGF geven) 125 ul van 10μg/mL b-FGF (tot een uiteindelijke concentratie van 0.25μg/mL b-FGF geven) alleen vereist als het kweken van cellen afkomstig van volwassen neurale cellen. 125 pl van 0,2% heparine, alleen vereist als het kweken van cellen afkomstig van volwassen neurale cellen. 60 pi van de juiste volledige NeuroCult Replenishment Medium (voor embryonale of volwassen cellen) wordt toegevoegd aan het midden van elk NCFC Assay gerecht eens in de 7 dagen tijdens de gehele NCFC Assay cultuur incubatie (21 dagen). 5. Scoring N-CFK Assay afgeleide Koloniën en berekening van de frequentie van bonafide NSCs en neurale progenitorcellen: Elke 35 mm cultuur schotel is geplaatst op een gerasterde scoren schotel met het rooster afmeting van 2,0 mm x 2,0 mm en vervolgens beide gerechten worden geplaatst op de microscoop podium. Het gebruik van laag vermogen (2,5 maal – 5X) objectief, elk gerecht wordt gescand en de kolonies worden gescoord op basis van hun grootte. Kolonies zijn ingedeeld in twee grote categorieën: Minder dan 2 mm diameter ≥ 2 mm diameter 6. Representatieve resultaten: Net als in neurosphere assay, cellen uitgeplaat in N-CFC-test start te laten groeien en maken kleine kolonies van cellen binnen 3 – 7 dagen na beplating (figuur 1). In twee weken tijd, kunnen kolonies van verschillende afmetingen worden onderscheiden. Terwijl de meerderheid van de kolonies hebben de neiging om te stoppen met groeien na 14 dagen, sommige kolonies blijven toenemen in omvang. Op dag 21, kan kolonies worden ingedeeld in een van de vier categorieën: 1) minder dan 0,5 mm diameter, 2) 0,5 – 1 mm diameter, 3) 1 – 2 mm diameter en 4) ≥ 2 mm in diameter. In de praktijk zijn kolonies kleiner dan 2 mm diameter aangeduid als progenitor afgeleid (figuur 2) en kolonies ≥ 2 mm in diameter worden aangeduid als NSC afgeleid (figuur 3). Het aantal kolonies ≥ 2 mm in diameter per totaal cellen uitgeplaat, vertegenwoordigt de frequentie van de werkelijke bonafide neurale stamcellen met de lange termijn zelf-vernieuwing en multi-potentiële mogelijkheden. De totale neurosphere de vorming van frequentie in een bepaalde cel populatie na 7-8 dagen in een parallel experiment NSA is geschat op ongeveer gelijk zijn aan de totale kolonievormende frequentie van de dezelfde cel bevolking na 21 dagen in een N-CFCA experiment. De N-CBVC echter, geeft een meer tolerante voorwaarde om zo elke cel kan zijn volledige proliferatieve potentieel te tonen. Bestanddeel 2 repliceert 3 repliceert 4 repliceert NeuroCult NCFC serum-vrij medium zonder Cytokines 1700 2550 3400 NeuroCult NSC Proliferatie Supplementen 330 495 660 EGF (10 ug / ml) 6.6 9.9 13,2 bFGF (10 ug / ml), alleen voor volwassen cellen 3.3 4.95 6.6 Heparine-oplossing (0,2%), alleen voor volwassen cellen 3.3 4.95 6.6 Penicilline / streptomycine (1:100) 32 48 64 Cellen op: 2,2 x 10 5 gekweekte cellen / ml of 6,5 x 10 5 primaire cellen / ml 25 37,5 50 Collageen Solution 1300 1950 2600 Tabel 1. Componenten van volledige N-CFK assay cultuur. Figuur 1. Vertegenwoordiger kolonies in N-CBVC cultuur van de passage een E14 muis NSCs 7 dagen na plating. De kolonies kunnen een verschillend morfologie en grootte. Originele vergroting; 4x Figuur 2. Vertegenwoordiger stamvader afgeleid kolonies van verschillende grootte in N-CBVC cultuur van de passage een E14 muis NSCs 21 dagen na plating. Zoals te zien is, de kolonies hebben verschillende morfologie, maar allemaal zijn minder 2 mm groot. Originele vergroting; 4x Figuur 3. Vertegenwoordiger van bona fide stamcellen afgeleid kolonie in N-CBVC cultuur van de passage een E14 muis NSCs 21 dagen na plating. Stamcellen afgeleid kolonies kunnen tonen verschillende morfologie (ziede video), maar alle zijn ≥ 2 mm in diameter. Originele vergroting; 4x