神经细胞集落形成细胞分析检测，以区分善意的神经祖细胞的神经干细胞

1。需要细胞电镀之前准备的项目： 完成国科会培养基的准备适当的音量NeuroCult NSC基础培养基和NeuroCult NSC增殖辅料，分别在9:1的比例混合。 NeuroCult NCFC无血清培养基的无细胞因子等分解冻。 在37℃水浴介质预热。 表皮生长因子（EGF），碱性成纤维细胞生长因子（b – FGF的）在浓度为10微克/毫升和0.2％肝素联合解决方案，提前准备。 根据实验的大小，需要几个35mm组织培养的菜肴板的细胞和一个150至200cm的塑料培养皿中，还需要举行重复的35mm菜和第三水35毫米菜。 2。细胞制备： 根据你的实验，细胞可从成人或胚胎的来源（主要分离组织或游离神经球）的准备。剖析从成人/胚胎小鼠中枢神经系统（CNS）组织或游离于前1,2，然后描述成人/胚胎源性神经球： 的是通过一个40微米大小的网状过滤器通过的单细胞悬液，以消除非游离团块。 台盼蓝90μl，进行细胞计数细胞悬液10μL 混合注 ：也可用于其他合适的细胞稀释。 如果使用的是初级胚胎或成人的神经细胞，稀释的细胞悬液浓度6.5 × 10 5细胞/毫升在完成国科会培养基。如果使用的是从成人或胚胎神经细胞产生的游离神经球细胞，稀释细胞悬液浓度2.2 × 10 5细胞/毫升在完成国科会培养基。 3。半固态的N – CFCA中等电镀细胞： 混合，以适当的音量以下几部分组成，上复制的数量而定。在这里，我们混合了两所需要的金额复制或重复的菜肴。复制其他号码，请参阅表1。 1.7毫升NeuroCult NCFC无血清培养基，无细胞因子 330μLNeuroCult NSC增殖辅料 6.6μL表皮生长因子（10μg/mL） 32μL青霉素/链霉素。 3.3μLB – FGF（10μg/mL）时才需要培养成人神经细胞产生的细胞。 3.3μL肝素（0.2％）时才需要培养成人神经细胞产生的细胞 。 25μL细胞悬液（2.2 × 10 5细胞/ ml的分离神经球或6.5 × 10 5细胞/毫升原代细胞从组织分离的中枢神经系统细胞）注：镀金的最后一个单元格的数字应约2500每35毫米培养皿中的细胞衍生的神经干细胞和7500细胞的原代细胞每35 mm培养皿。在某些情况下，最终细胞电镀密度要通过执行一个单元滴定实验调整。对于统计分析，经过21天的文化检测菌落总数应在范围内至少有50 – 150菌落。 轻轻地，然后是混合细胞的培养基中含有1.3毫升冷胶原溶液转移到细胞悬液，轻轻吹打混合，以避免任何气泡。 的混合溶液配发到每个35mm的培养皿（〜1.5毫升/皿）的中心和菜都轻轻放倒，使用打圈，让分布在菜的表面均匀的混合物。 。 重复35毫米培养皿中放入一个100毫米的Petri板。新的35毫米培养皿的盖子被删除，开放的菜也是相同的100毫米的培养皿中。无菌水添加到这个开放的35毫米盘保持在孵化期间的最佳湿度。广场生物测定板（245毫米），使用时复制35毫米的菜已经建立起来。同样，包括2个或3开放35 mm培养皿无菌水。 板块转移一个孵化器设定在37℃，5％CO2和95％的湿度。通过增加温度和凝胶形成的胶原蛋白凝结会发生在大约一个小时。的文化不应该在此期间受到干扰。 培养的细胞培养21天（群体规模的差异，在21天以后可以清楚地分辨）。 4。准备增资的中型和喂养文化： 孵育时间（21天）的延长期的N – CFCA文化，文化应投喂与适当的完整NeuroCult 增资中期准备新鲜如下： NeuroCult NSC基础培养基的4.5毫升混合0.5米NeuroCult NSC增殖辅料，然后生长因子的L是： 250μL10μg/mL表皮生长因子（给予终浓度为0.5μg/ mL的EGF） 125μLB – FGF10μg/mL（给予终浓度为0.25μg/mLB – FGF） 时才需要培养成人神经细胞产生的细胞。 125μL0.2％肝素， 只有培养成人神经细胞产生的细胞。 60μL适当完成NeuroCult补货中（胚胎或成年细胞）添加到每个NCFC含量菜每7天一次，在整个NCFC含量文化潜伏期（21天）的中心。 5。得分的N – CFC含量派生殖民地和真正的神经干细胞和神经祖细胞的频率计算： 每个35 mm培养皿放置在一个2.0毫米× 2.0毫米的网格大小的网格得分菜，两个菜，然后放在显微镜舞台上。 使用低功率（2.5倍 – 5倍）物镜，每道菜扫描，并根据它们的大小的殖民地都取得了。 殖民地分为两大类： 直径小于2毫米直径≥2毫米 6。代表性的成果： 由于在检测神经球，在镀上的N – CFC检测的细胞开始增殖，使细胞内的小菌落电镀后3 – 7天（图1）。在两个星期的时间，可以区分不同大小的菌落。虽然大多数的殖民地往往在14天后停止增长，一些殖民地继续扩大规模。第21天，菌落可分为四类：1）直径小于0.5毫米，2）0.5 – 1毫米直径，3）1 – 2毫米直径4）直径≥2毫米。实际上，小于2毫米直径的殖民地被称为祖派生（图2）和殖民地≥直径2mm被称为国科会派生（图3）。殖民地≥2毫米每镀细胞总数的直径，代表长期的自我更新和多潜能的能力，实际真正的神经干细胞的频率。据估计总的神经球，在一个特定的细胞群形成后7-8天在一个平行的国家安全局实验的频率类似的总菌落形成后21天在一个N – CFCA实验相同的细胞群的频率。的N – CFCA然而，提供了一个更宽松的条件，使每个单元可以充分显示其增殖潜力。 组件 2复制 重复3次 4个重复 NeuroCult NCFC无细胞因子的无血清培养基 1700 2550 3400 NeuroCult国科会扩散辅料 330 495 660 EGF（10微克/毫升） 6.6 9.9 13.2 碱性成纤维细胞生长因子（10微克/毫升）， 仅适用于成年细胞 3.3 4.95 6.6 肝素溶液（0.2％）， 仅适用于成年细胞 3.3 4.95 6.6 青霉素/链霉素（1:100） 32 48 64 细胞在： 2.2 × 10 5培养细胞/ mL或 6.5 × 10 5的主要细胞/ ml 25 37.5 50 胶原溶液 1300 1950年 2600 表1。完整的N – CFC检测文化的组成部分。 图1 CFCA的N -通道之一，E14小鼠的NSCs文化的代表殖民地后7天电镀。殖民地可能会显示不同的形态和大小。原始的放大倍率; 4X 图2不同大小的N – CFCA通过文化之一，E14电镀后21天的小鼠的NSCs的代表祖派生殖民地。如图所示，殖民地有不同的形态，但都少2毫米大小。原始的放大倍率; 4X 图3。代表真正的干细胞衍生的N – CFCA通过电镀后21天之一，E14小鼠的NSCs的文化殖民地。干细胞衍生的殖民地，可能会显示不同的形态（见视频），但所有≥2毫米直径。原始的放大倍率; 4X