Dérivation des thymique lymphome à cellules T à partir des lignes Atm - / -</sup Et - / -</sup Souris
Summary
Dans cette vidéo, nous démontrons un protocole pour établir la souris des lignées cellulaires de lymphome thymique. En suivant ce protocole, nous avons établi avec succès plusieurs lignées de lymphocytes T de l'ATM-/ – et p53-/ – ont un lymphome thymique.
Abstract
Des lignées cellulaires établies sont un outil de recherche critique qui peut réduire l'utilisation des animaux de laboratoire dans la recherche. Certaines souches de souris génétiquement modifiées, telles que ATM – / – et p53 – / – constamment développer un lymphome thymique tôt dans la vie 1,2, et donc, peut servir comme une source fiable pour la dérivation de cellules T murines lignes. Nous présentons ici un protocole détaillé pour le développement des établis murin thymique lymphome à cellules T lignes sans avoir besoin d'ajouter les interleukines comme décrit dans les protocoles antérieurs 1,3. Les tumeurs ont été récoltés à partir des souris âgées de trois à six mois, à la première indication de tumeurs visibles basée sur l'observation d'une posture voûtée, respiration laborieuse, le toilettage pauvres et gaspiller dans une souche sensible 1,4. Nous avons établi avec succès plusieurs lignées de lymphocytes T en utilisant ce protocole et de souches pures de l'ATM – / – [FVB/N- Atm tm1Led / J] 2 et p53 – / – [129/S6- Trp53 tm1Tyj / J] 5 souris. Nous avons également démontré que plus de 90% de la place des cellules T CD3 population exprime, CD4 et CD8. Conformément aux lignées cellulaires établies de façon stable, les cellules T générées par l'utilisation du présent protocole ont été repiquées pendant plus d'un an.
Protocol
Discussion
Dans ce protocole, nous fournir des procédures détaillées pour établir murin lignées de lymphocytes T à partir de deux génotypes différents de souris; ATM – / – [FVB/N- Atm tm1Led / J] et p53 – / – [129/S6- Trp53 tm1Tyj / J] . En utilisant ce protocole, un total de 6 (sur 7 tentatives) ATM – / – et trois (sur 5 tentatives) p53 – / – murins lignées de lymphocytes T ont été établis dans notre…
Disclosures
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
Les auteurs tiennent à remercier le Dr Boris Reizis du Département de microbiologie et immunologie à l'Université Columbia pour des discussions utiles. Nous tenons aussi à remercier le Dr Margaret Bynoe, le Dr Rodman Getchell et Deequa Mahamed du Département de microbiologie et immunologie à la faculté de médecine vétérinaire, Université de Cornell pour l'assistance technique avec la cytométrie de flux et Lu Huang de l'aide pour le montage vidéo. Les auteurs souhaitent également remercier les membres de Duhamel et Weiss laboratoires pour leur examen critique de la production de manuscrits et de la vidéo, et Stephanie Yazinski du laboratoire Weiss pour la reproduction et le génotypage p53 – / – souris. Expériences sur les animaux ont été effectuées en conformité avec les directives et règlements établis par l'Université Cornell en soins des animaux et du Comité institutionnel d'utilisation. Cette recherche a été financée en partie par des fonds fournis par le département américain de l'Agriculture, Cooperative State Research, Education, and Extension Service de santé animale, et de recherche pour la maladie (au GED et TSI) et des subventions des NIH R03 HD058220 et R01CA108773 (à RSW). La vidéo a été produite en utilisant des installations internes par le personnel des laboratoires de Duhamel & Weiss.
Materials
- Ice bucket
- 70% ethanol
- Dissection pad consisting of foam block covered with aluminum foil and pins
- Two sets of small sterile scissors and forceps
- Sterile 150 mm2 Petri dish (Thermo Fisher Scientific, Waltham, MA; cat. #08-757-13)
- Sterile 18 gauge needles
- 50 mL conical tubes (Corning Inc., Corning NY; cat # 430829)
- 10% buffered formalin
- Tissue culture flasks
- T-25 (TPP, Trasadingen, Switzerland; cat # 90025)
- T-75 (TPP, Trasadingen, Switzerland; cat # 90075)
- 6-well plates (Corning Inc., Corning NY; cat # 3506)
- Sterile phosphate buffered saline pH 7.2 (PBS)
- Culture medium
- RPMI 1640 with 25 mM HEPES, 200 mM L-glutamine (Lonza, Walkersville, MD; cat#12-115F) supplemented with the following:
- 10% heat inactivated (56°C, 30 min) fetal bovine serum (FBS; Hyclone, Logan, UT; cat# SH30088.03)
- 1% penicillin and streptomycin (Mediatech, Manassas,VA; cat# 30-002-CI)
- 1% nonessential amino acids (Mediatech; cat#25-025-CI)
- 55 mM 2β-mercaptoethanol (Sigma, St Louis, MO; cat#M752)
- RPMI 1640 with 25 mM HEPES, 200 mM L-glutamine (Lonza, Walkersville, MD; cat#12-115F) supplemented with the following:
- Dimethyl sulfoxide (DMSO; Calbiochem, La Jolla, CA; cat # 317275)
- Antibodies (eBioScience, San Diego, CA)
- anti-CD3-FITC (cat. #11-0031-85)
- anti-CD4-APC (cat. #17-0041-83)
- anti-CD8-PE (cat.#12-081-85)
- Bovine serum albumin (BSA; Life Technologies, Grand Island, NY; cat #. 11018-017)
- Concanavalin A (Sigma cat# C5275)
- 1.8 mL freezing vials (Nunc, Roskilde, Denmark; cat# 368632)
References
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