Вывод тимуса лимфомы Т-клеточных линий из Atm - / -</sup И Р53 - / -</sup Мыши
Summary
В этом видео мы продемонстрируем протокол установить мышь тимуса клеточных линиях лимфомы. Следуя этому протоколу, мы успешно создано несколько Т-клеточных линий из банкоматов-/ – и p53-/ – мышей с лимфомой тимуса.
Abstract
Основанная клеточных линий являются одним из важнейших инструментов исследования, которые могут уменьшить использование лабораторных животных в научных исследованиях. Некоторые штаммы генетически модифицированных мышей, таких как ATM – / – и р53 – / – последовательно развивать вилочковой железы лимфомы в раннем возрасте 1,2, и, таким образом, может служить надежным источником для вывода мышиные Т-клеточных линиях. Здесь мы представляем подробный протокол для развития создан мышиной лимфомы тимуса Т-клеточных линий без необходимости добавлять интерлейкины, как описано в предыдущих протоколах 1,3. Опухоли были собраны от мышей в возрасте от трех до шести месяцев, при первой указанием видимых опухолей основана на наблюдении выгибание спины, затрудненное дыхание, плохой уход и тратить в 1,4 восприимчивы напряжения. Мы успешно создано несколько Т-клеточных линий с использованием этого протокола, и инбредных линий банкоматов – / – [FVB/N- Атм tm1Led / J] 2 и p53 – / – [129/S6- Trp53 tm1Tyj / J] 5 мышей. Кроме того, мы показали, что более 90% от установленной Т-клеточной популяции выражает CD3, CD4 и CD8. В соответствии со стабильно установленных линий клеток, Т-клеток, созданный с помощью данного протокола были пассировать в течение года.
Protocol
Discussion
В этом протоколе, мы предоставляем подробные процедуры создания мышиные Т-клеточных линий от двух разных генотипов мыши; атм – / – [FVB/N- Атм tm1Led / J] и р53 – / – [129/S6- Trp53 tm1Tyj / J] . Используя этот протокол, в общей сложности 6 (из 7 попыток) атм – / – ?…
Disclosures
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
The authors wish to thank Dr. Boris Reizis from the Department of Microbiology and Immunology at Columbia University for helpful discussions. We also wish to thank Dr. Margaret Bynoe, Dr. Rodman Getchell and Deequa Mahamed from the Department of Microbiology and Immunology at the College of Veterinary Medicine, Cornell University for technical assistance with flow cytometry and Lu Huang for assistance with video editing. The authors also wish to thank the members of Duhamel and Weiss laboratories for their critical review of the manuscript and video production, and Stephanie Yazinski from the Weiss laboratory for breeding and genotyping p53-/- mice. Experiments on animals were performed in accordance with the guidelines and regulations set forth by Cornell University Institutional Animal Care and Use Committee. This research was supported in part by funds provided by the US Department of Agriculture, Cooperative State Research, Education, and Extension Service, Animal Health and Disease Research Program (to G.E.D. and R.S.W.) and NIH grants R03 HD058220 and R01CA108773 (to R.S.W). The video was produced using in-house facilities by the personnel from the Duhamel & Weiss laboratories.
Materials
- Ice bucket
- 70% ethanol
- Dissection pad consisting of foam block covered with aluminum foil and pins
- Two sets of small sterile scissors and forceps
- Sterile 150 mm2 Petri dish (Thermo Fisher Scientific, Waltham, MA; cat. #08-757-13)
- Sterile 18 gauge needles
- 50 mL conical tubes (Corning Inc., Corning NY; cat # 430829)
- 10% buffered formalin
- Tissue culture flasks
- T-25 (TPP, Trasadingen, Switzerland; cat # 90025)
- T-75 (TPP, Trasadingen, Switzerland; cat # 90075)
- 6-well plates (Corning Inc., Corning NY; cat # 3506)
- Sterile phosphate buffered saline pH 7.2 (PBS)
- Culture medium
- RPMI 1640 with 25 mM HEPES, 200 mM L-glutamine (Lonza, Walkersville, MD; cat#12-115F) supplemented with the following:
- 10% heat inactivated (56°C, 30 min) fetal bovine serum (FBS; Hyclone, Logan, UT; cat# SH30088.03)
- 1% penicillin and streptomycin (Mediatech, Manassas,VA; cat# 30-002-CI)
- 1% nonessential amino acids (Mediatech; cat#25-025-CI)
- 55 mM 2β-mercaptoethanol (Sigma, St Louis, MO; cat#M752)
- RPMI 1640 with 25 mM HEPES, 200 mM L-glutamine (Lonza, Walkersville, MD; cat#12-115F) supplemented with the following:
- Dimethyl sulfoxide (DMSO; Calbiochem, La Jolla, CA; cat # 317275)
- Antibodies (eBioScience, San Diego, CA)
- anti-CD3-FITC (cat. #11-0031-85)
- anti-CD4-APC (cat. #17-0041-83)
- anti-CD8-PE (cat.#12-081-85)
- Bovine serum albumin (BSA; Life Technologies, Grand Island, NY; cat #. 11018-017)
- Concanavalin A (Sigma cat# C5275)
- 1.8 mL freezing vials (Nunc, Roskilde, Denmark; cat# 368632)
References
- Barlow, C. Atm-deficient mice: a paradigm of ataxia telangiectasia. Cell. 86, 159-171 (1996).
- Elson, A. Pleiotropic defects in ataxia-telangiectasia protein-deficient mice. Proc Natl Acad Sci U S A. 93, 13084-13089 (1996).
- Kuang, X. Control of Atm-/- thymic lymphoma cell proliferation in vitro and in vivo by dexamethasone. Cancer Chemother Pharmacol. 55, 203-212 (2005).
- Browne, S. E. Treatment with a catalytic antioxidant corrects the neurobehavioral defect in ataxia-telangiectasia mice. Free Radic Biol Med. 36, 938-942 (2004).
- Jacks, T. Tumor spectrum analysis in p53-mutant mice. Curr Biol. 4, 1-7 (1994).
- Chervinsky, D. S., Lam, D. H., Zhao, X. F., Melman, M. P., Aplan, P. D. Development and characterization of T cell leukemia cell lines established from SCL/LMO1 double transgenic mice. Leukemia. 15, 141-147 (2001).
- Sharma, V. M. Notch1 contributes to mouse T-cell leukemia by directly inducing the expression of c-myc. Mol Cell Biol. 26, 8022-8031 (2006).
- Maser, R. S. Chromosomally unstable mouse tumours have genomic alterations similar to diverse human cancers. Nature. 447, 966-971 (2007).
