Timik Lenfoma T-hücre Hatları türetilmesi Atm - / -</sup Ve P53 - / -</sup Fare
Summary
Bu video, fare timik lenfoma hücre hatları kurmak için bir protokol göstermektedir. Ve p53-/ – farelerde timus lenfoma ile bu protokolü takip ederek, başarıyla birkaç Atm / T-hücre hatları kurduk.
Abstract
Kurulan hücre hatları araştırma laboratuvar hayvanları kullanımını azaltmak kritik bir araştırma aracı. ATM gibi genetiği değiştirilmiş farelerde Bazı suşları / – ve p53 – / – sürekli erken ömrü 1,2 timik lenfoma geliştirmek, ve böylece, fare T-hücre hatları türetilmesi için güvenilir bir kaynak olarak hizmet verebilir. Burada gerek kalmadan önceki protokoller 1,3 açıklandığı gibi interlökinler eklemek için kurulan fare timik lenfoma T-hücre gelişimi için ayrıntılı bir protokol mevcut. Tümörler, hunched duruş gözlem dayalı görünür tümörlerin erken göstergesi, üç ila altı ay arası farelerden alınan hasat nefes alma, yetersiz bakım ve duyarlı bir gerginlik 1,4 de israf yorucu. / – [FVB/N- Atm tm1Led / J] 2 ve p53 – / – [129/S6- Trp53 tm1Tyj / J] 5 fareler Biz bu protokolü kullanarak çeşitli T-hücre hatları ve Atm kendilenmiş suşları başarıyla kurduk. Daha kurulan T-hücre nüfusunun% 90'dan daha fazla CD3, CD4 ve CD8 ifade ettiğini göstermektedir. Stably kurulan hücre hatları ile tutarlı, mevcut protokolü kullanılarak üretilen T-hücrelerinin, bir yılı aşkın bir süredir geçişli olmuştur.
Protocol
Discussion
Bu protokolde, iki farklı fare genotipleri fare T-hücre hatları kurmak için ayrıntılı yordamlar sağlar; – / – [FVB/N- Atm tm1Led / J] ve p53 – / – Atm [129/S6- Trp53 tm1Tyj / J] . / – Ve üç (5 girişimleri), p53 – / – Bu protokol, 6 olmak üzere toplam (7 girişimleri) Atm kullanarak fare T-hücre laboratuvarda kurulmuştur. / – Bu hücre hattı DWJ-Atm-1, bir <em…
Disclosures
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
Yazarlar, Columbia Üniversitesi Mikrobiyoloji ve İmmünoloji Anabilim Dalı Dr. Boris Reizis yararlı tartışmalar için teşekkür etmek istiyorum. Ayrıca, akım sitometri ve video düzenleme ile ilgili yardım için Lu Huang ile teknik yardım için, Cornell Üniversitesi Veteriner Fakültesi Mikrobiyoloji ve İmmünoloji Anabilim Dalı Dr Margaret Bynoe, Dr. Rodman Getchell ve Deequa Mahamed teşekkür etmek istiyoruz. / – Fareler Yazarlar ayrıca p53 ıslahı ve genotipleme için kritik gözden geçirilmesi, el yazması ve video prodüksiyon ve Stephanie Yazinski Weiss laboratuvar Duhamel ve Weiss laboratuarlar üyelerine teşekkür etmek istiyorum. Cornell Üniversitesi Kurumsal Hayvan Bakım ve Kullanım Kurulu tarafından belirlenen kurallara ve yönetmeliklere uygun olarak hayvanlar üzerinde deneyler yapıldı. Bu araştırma, ABD Tarım Departmanı, Kooperatif Devlet Araştırma, Eğitim, ve Yayım Hizmetleri, Hayvan Sağlığı ve Hastalıkları Araştırma Programı (GED ve RSW) ve NIH hibe R03 HD058220 ve R01CA108773 (RSW) tarafından sağlanan fonları tarafından kısmen desteklenmiştir. Video Duhamel & Weiss laboratuvarların personeli tarafından in-house imkanlarını kullanarak imal edilmiştir.
Materials
- Ice bucket
- 70% ethanol
- Dissection pad consisting of foam block covered with aluminum foil and pins
- Two sets of small sterile scissors and forceps
- Sterile 150 mm2 Petri dish (Thermo Fisher Scientific, Waltham, MA; cat. #08-757-13)
- Sterile 18 gauge needles
- 50 mL conical tubes (Corning Inc., Corning NY; cat # 430829)
- 10% buffered formalin
- Tissue culture flasks
- T-25 (TPP, Trasadingen, Switzerland; cat # 90025)
- T-75 (TPP, Trasadingen, Switzerland; cat # 90075)
- 6-well plates (Corning Inc., Corning NY; cat # 3506)
- Sterile phosphate buffered saline pH 7.2 (PBS)
- Culture medium
- RPMI 1640 with 25 mM HEPES, 200 mM L-glutamine (Lonza, Walkersville, MD; cat#12-115F) supplemented with the following:
- 10% heat inactivated (56°C, 30 min) fetal bovine serum (FBS; Hyclone, Logan, UT; cat# SH30088.03)
- 1% penicillin and streptomycin (Mediatech, Manassas,VA; cat# 30-002-CI)
- 1% nonessential amino acids (Mediatech; cat#25-025-CI)
- 55 mM 2β-mercaptoethanol (Sigma, St Louis, MO; cat#M752)
- RPMI 1640 with 25 mM HEPES, 200 mM L-glutamine (Lonza, Walkersville, MD; cat#12-115F) supplemented with the following:
- Dimethyl sulfoxide (DMSO; Calbiochem, La Jolla, CA; cat # 317275)
- Antibodies (eBioScience, San Diego, CA)
- anti-CD3-FITC (cat. #11-0031-85)
- anti-CD4-APC (cat. #17-0041-83)
- anti-CD8-PE (cat.#12-081-85)
- Bovine serum albumin (BSA; Life Technologies, Grand Island, NY; cat #. 11018-017)
- Concanavalin A (Sigma cat# C5275)
- 1.8 mL freezing vials (Nunc, Roskilde, Denmark; cat# 368632)
References
- Barlow, C. Atm-deficient mice: a paradigm of ataxia telangiectasia. Cell. 86, 159-171 (1996).
- Elson, A. Pleiotropic defects in ataxia-telangiectasia protein-deficient mice. Proc Natl Acad Sci U S A. 93, 13084-13089 (1996).
- Kuang, X. Control of Atm-/- thymic lymphoma cell proliferation in vitro and in vivo by dexamethasone. Cancer Chemother Pharmacol. 55, 203-212 (2005).
- Browne, S. E. Treatment with a catalytic antioxidant corrects the neurobehavioral defect in ataxia-telangiectasia mice. Free Radic Biol Med. 36, 938-942 (2004).
- Jacks, T. Tumor spectrum analysis in p53-mutant mice. Curr Biol. 4, 1-7 (1994).
- Chervinsky, D. S., Lam, D. H., Zhao, X. F., Melman, M. P., Aplan, P. D. Development and characterization of T cell leukemia cell lines established from SCL/LMO1 double transgenic mice. Leukemia. 15, 141-147 (2001).
- Sharma, V. M. Notch1 contributes to mouse T-cell leukemia by directly inducing the expression of c-myc. Mol Cell Biol. 26, 8022-8031 (2006).
- Maser, R. S. Chromosomally unstable mouse tumours have genomic alterations similar to diverse human cancers. Nature. 447, 966-971 (2007).
