Yüksek Verimli MicroRNA Profil: Optimize edilmiş, Multiplex QRT-PCR Fluidigm Dinamik ArrayTM IFCS Nanoliter Ölçeğinde

1. RNA Ekstraksiyon: Hücreler Monolayer de Yetiştirilen (TRIzol kullanarak üreticinin protokol.) Reaktifin Adı Şirket / Cat eşya # TRIzol Çözüm Invitrogen 15596-018 Izopropil alkol Sigma-Aldrich 1907-1964 Kloroform Sigma-Aldrich C 2432 Etanol RNAse ücretsiz su Homojenizasyon Trizol etrafında girdap, 10 cm 2 çanak alan başına 1 ml Trizol Çözüm ekleyerek doğrudan kültür tabağına hücreleri homojenize ve plakası tam kapsama sağlamak için pipet ve aşağı yukarı. Faz Ayırma Homojenize örnek oda sıcaklığında 5 dakika inkübe edin. Etiketli bir tüp içine aktarın, 1ml TrizolSolution başına 0.2 ml kloroform ekleyin ve 15 saniye boyunca el ile tüp kuvvetlice sallayın. 3 dakika oda sıcaklığında inkübe edin. 12.000 xg'de örnek Santrifüj az 15 dakika boyunca 2 ° C Santrifüj sonra karışımı daha düşük bir kırmızı faz, bir interfaz ve RNA içeren renksiz bir üst sulu faz ayrılır ve toplam Trizol Çözüm hacmi% 60 olmalıdır. RNA Yağış RNA taze, etiketli tüpe faz içeren sulu aktarın. Trizol Çözüm 1 ml başına 0.5 ml izopropil alkol ekleyerek RNA çöktürün. Örnekleri oda sıcaklığında 10 dakika inkübe edin. 10 dakika boyunca 12.000 xg'de santrifüjleyin 2 ° C RNA yıkama Santrifüj sonrasında tüplerin süpernatant atın. % 75 etanol Trizol Çözüm, girdap 1 ml başına en az 1 ml ekleyerek RNA pelet (tüp Yan ve alt) yıkayın. 5 dakika 7500 xg'de santrifüjleyin 2 ° C RNA Elüsyon Süpernatantı atın ve 1 dakika için tekrar santrifüj. Aşırı sıvı çıkarın. Hava-kuru pelet 5-10 dakika. Not: Kurutulmuş RNA üzerinde zor çözünür. RNaz ücretsiz su pelet çözüm yukarı ve aşağı pipetleme tarafından çözülür ve 10 dakika boyunca inkübe 55 ° C Nanodrop ™ spektrofotometre kullanılarak RNA konsantrasyonu (A260/280 oranı) ölçün. Kullanılmak üzere -80 ° C ye kadar hazır saklayınız. 2. RNA Ekstraksiyon: Serum (Ardından Mirvana PARIS Kit üretici protokolü Mitchell ve arkadaşları tarafından modifiye 1) Reaktifin Adı Şirket / Cat eşya # Yorumlar mir Vana PARIS Kiti 2X denatüre Çözüm Asit-Fenol: Kloroform miRNA Yıkama Çözüm 1 miRNA Yıkama Çözeltisi 2 / 3 Ambion AM1556 Modifiye protokolü 2-mercaptoethanol Sigma-Aldrich M7522 Etanol DEPC Su tedavi Kimyasal Hazırlanışı: 2-merkaptoetanol 375 ul 2X denatüre Çözüm ekleyin ve iyice karıştırın. Çözüm 1 miRNA yıkama için 21 ml% 100 etanol ekleyin. MiRNA yıkama Çözüm 2 / 3, 40 ml% 100 etanol ekleyin. Numune Hazırlama: Buz üzerinde serum örnek çözülme. Homojenizasyon 2X denatüre Çözüm eşit hacimli (300 ul) (oda sıcaklığında olmalı) ve vorteks ile 300 ul örnek karıştırın. 5 dakika buz karışımı inkübe edin. Asit-Fenol hacmi ekleyin: örnek lizat artı 2X denatüre Çözüm (600 ul) toplam hacmine eşit Kloroform. Önemli: Kloroform: Asit-Fenol üstünde yer alan sulu tampon kullanmayın. Vorteks karışımı 60 saniye boyunca. Maksimum hız (> 10.000 xg) 15 dakika boyunca oda sıcaklığında santrifüjleyin. Santrifüj sonra karışımı bir üst sulu faz, interfaz ve daha düşük bir organik faz ayrılır. Aque çıkarınlı üst katmanı (300 olması gerekir herhangi bir proteinacious "puslu" katmanı da dahil olmak üzere 500 ul). Re-ayıklamak kloroform tekrar ekleyerek daha önce olduğu gibi sulu tabaka. Önemli: ikinci ekstraksiyon sulu tabaka (250 ul) hacim olarak rutin küçük. Ses iyileşti Not. Final RNA İzolasyon (toplam RNA) hazırlanması Ön ısıtma (95 ° C) nükleaz içermeyen su. % 100 Etanol, oda sıcaklığında olmalıdır. Final RNA İzolasyon (toplam RNA) Kurtarılan sulu faz (örneğin 300 ul kurtarıldı, 375 ul etanol)% 100 etanol 1.25 birimleri ekleyin ve iyice karıştırın. Her bir örnek için, filtre kartuşu toplama tüpleri birine yerleştirin. Filtre üzerine lizat Pipet. Santrifüj (10.000 xg) 30 saniye boyunca, akış yoluyla atmak için tekrar 30 saniye santrifüj ve aynı toplama tüpünün içine filtre kartuşunu değiştirin. RNA Yıkama 700 ul miRNA Yıkama Çözüm 1 uygulayın, 15 saniye için filtre kartuşu ve santrifüj toplama tüpünden akış üzerinden atmak ve aynı toplama tüpünün içine filtre kartuşunu değiştirin. Flow-through atmak ve tekrar ikinci bir 500 ul Yıkama Çözeltisi 2 / 3 ile 15 saniye, 500 ul miRNA Yıkama Çözeltisi 2 / 3, santrifüj uygulayın. 1-2 dakika akış ve kuru-spin atın. Yeni bir toplama tüpüne koyun filtre kartuşu, 100 ul RNAse ücretsiz su (95 ° C), yakın kapak ve 2 dakika boyunca inkübe geçerlidir. ~ 2 dakika RNA kurtarmak için santrifüjleyin. Mağaza -80 ° C kullanana kadar. 3. RNA Çözüm Konsantrasyon (5X) (Üretimi protokol) Reaktifin Adı Şirket / Cat eşya # MICROCON Santrifüj Filtre Cihazlar, Ultracell YM-3 Millipore 42404 DEPC Su tedavi Aygıt: Microcon Ultracell YM-3, Kesim SS ve DS Nükleotidler: 10 Cilt: İstenen hacmi yeniden konsantre RNA çözüm, deneysel tasarım bağımlı ve kontrol deneyleri içermelidir . Microcon örnek rezervuar rezervuar içine şişe ve pipet çözüm içine yerleştirin. Not: membran dokunmayın. 185 dakika santrifüj 4 ° C maksimum 14.000 x g. Not: Rotor doğru çatlak bandı ile pozisyon flakon. 4 3 dakika için yeni şişe ve spin RNAse serbest su rezervuar üzerine Pipet istenilen hacmi (örneğin 20 ul), yer rezervuar içine ters ° C maksimum 3000 x g. Mağaza -80 ° C kullanana kadar. 4. Ters Transkripsiyon (Değişiklikler ile Tang ve arkadaşları tarafından bir protokol. 2.) Reaktifin Adı Şirket / Cat eşya # Yorumlar Yüksek kapasiteli cDNA arşiv kiti 10x cDNA arşivleme Tampon dNTP (100 mM) Moloney fare lösemi virüsü (MMLV) transkriptaz (50 U / ml) ters Applied Biosystems 4368814 modifiye protokol RNaseOUT (40 U / ml) Invitrogen 10777019 x-plex ters kök döngü astar karışımı (40 nM) * Integrated DNA Technologies Özel Dizileri * DEPC Su tedavi Reaksiyon Cilt: 5.5 ul Not: kök döngü primerler nihai konsantrasyonu 1-5 nM (burada 2 nM) olmalıdır. Master-Mix (tepki ortalama Birimleri) aşağıdaki gibi hazırlayın: 1. DEPC-Su 1.959 ul 2. RT-Tampon 10x 0.55 ul 3. RNaz İnhibitör (40 U / ml) 0,0715 ul 4. dNTP (100 mM) 0.275 ul 5. x-plex ters kök döngü astar karışımı (40 nM) * 0.275 ul 6. MMLV RT (50 U / ml) 0,369 ul Mix ve santrifüj kısaca. 2 ul örnek Master Mix 3.5 ul ekleyin. Aşağıdaki RT-tepki gerçekleştirin: 20 60 çevrimleri ile 30 dakika süreyle 16 ° C, ° C 30 saniye, 42 ° C, 30 saniye boyunca 50 ° C için 1, ikinci ve son olarak 85 ° C, MMLV-RT, 4 inaktive 5 dakika boyunca ° C ∞ . Kullanana kadar -20 ° C'de saklayın. * Ters kök döngü primerler listesi bulunabilir http://urology.ucsf.edu/blellochlab/protocols.htm 5. Ön Amplifikasyon (Pre-PCR) (Değişiklikler ile Tang ve arkadaşları tarafından bir protokol. 2.) Reaktifin Adı Şirket / Cat eşya # Yorumlar dNTP (100 mM) Applied Biosystems 4368814 Yüksek kap. cDNA arşiv Kiti. NoAmpErase UNG 2x Universal PCR Master Mix Applied Biosystems 4324018 x-plex ileri astar karışımı (450 nM) * Integrated DNA Technologies Özel Dizileri * Evrensel Ters Astar (100 mcM) Integrated DNA Technologies Özel Sıra 2 AmpliTaqGold polimeraz (5 U / ml) Applied Biosystems 4311806 MgCl 2 (100 mM) DEPC Su tedavi Reaksiyon Cilt: 27.5μl (22μl AA + 5.5μl RT-Ürün) Not: Ön Amplifikasyon RNA başlangıç ​​konsantrasyonu özellikle sınırlı, sinyal gücünü artırmak için gerekli. Giriş RNA seviyesi Pre-PCR döngüleri optimal sayısını belirler. Aynı göreceli verimlilik göz önüne alındığında her PCR döngüsü nihai ürünün konsantrasyonu iki katına çıkacaktır. Bazı miRNA'lar daha yüksek ifade olacağından, bisiklet üzerinde kaçının. Ancak, özellikle düşük seviyelerde ifade microRNA amplifikasyon altında, algılama hassasiyet kaybına neden olabilir. Toplam RNA 100ng kullanarak 12 öncesi amplifikasyon döngüsü, elimizde yeterli çıktı. Başlangıç ​​materyali, saptanabilir miRNA düzeyleri 12 kür, ancak üstün olduğu ortaya çıktı 15 döngü olarak serum kullanma. Son olarak, 3 oosit (oosit 3 başına yaklaşık 400 pg toplam RNA), 16 preamplifikatörde döngüsü ile başlayan başarıyla microRNA ekspresyon düzeyleri 4 için ekran için bize izin verdi. * Ileri primerler listesi bulunabilir http://urology.ucsf.edu/blellochlab/protocols.htm Master-Mix (tepki ortalama Birimleri) aşağıdaki gibi hazırlayın: 1. 2x Evrensel AA 13.75 ul 2. DEPC-Su 0,792 ul 3. MgCl 2 (100 mM) 0.55 ul 4. dNTP (100 mM) 1.1 ul 5. x-plex ileri astar karışımı (450 nM) 3.06 ul 6. Evrensel RP (100 mcM) Ul 1,375 7. AmpliTaqGold polimeraz (5 U / ml) Ul 1,375 Mix ve kısaca santrifüj. Her 5.5 ul RT-Ürün 22 ul Master-Mix ekleyin. Aşağıdaki Pre-PCR gerçekleştirin: 10 dakika süreyle 95 ° C, 55 ° C 'de 2 dakika süreyle, 10 – 1 ve 65 – 95 ° C 18 kür ° C 1 dakika boyunca, 4 ° C ∞. 6. Pre-PCR Ürün saflaştırılması % 10 yerli poliakrilamid jel boyutu seçimi Arıtma Reaktifin Adı Şirket / Cat eşya # % 40 Akrilamid / Bis Çözüm Bio-Rad 161-0144 TEMED Bio-Rad 161-0801 10 bp DNA merdiveni Invitrogen 10821-015 SYBR Altın nükleik asit jel leke DMSO 10.000 X konsantre Invitrogen S11494 Glikojen (20 mg / ml) Roche 10 901 393 001 Tampon-EB % 10 Ammoniumpersulfate (APS) TEN-Buffer 6x Turuncu G DEPC Su tedavi ddH2O a. Jel Hazırlık 10ml% 10 poliakrilamid karışımı ekleyin yapmak için 1. GKD 2 O 6,5 ml 2. 10x TBE 1 ml 3. Poliakrilamid (% 40) 2.5 ml 4. APS (% 10) 80 ul 5. TEMED 4 ul DNA merdiven hazırlayın: 0.5 ul 10 bp DNA merdiveni 4.5 ul Tampon (EB) 1 ul 6x Turuncu G Her 27.5 ul Pre-PCR ürününün 5.5 ul 6x Turuncu G ekleyin. b. Jel çalıştırın 55-60 dakika için 150V ile Jel çalıştırın. Not: göstergesi olarak Bromofenol mavi 20bp bölge ile çalışır. c. Jel Leke Çalkalayıcı üzerinde 25 dakika süreyle SYBR-Gold ile jel Leke. Not: SYBR-Gold ışığa karşı hassastır. d. Jel Kes 60-80 bp Pre-PCR ürün grubu kesin ve etiketli tüp transferi. Not: düşük RNA giriş Pre-PCR ürünleri için bir bant görünür olmayabilir. Jel bandı (örneğin tüp santrifüj tüp) Crush. e. Re-Özü cDNA 300 ul ekle TEN az 37-Tampon ve inkübe ° C 4 saat rotator. Etiketli bir toplama tüpüne transfer sıvı jel içeren tüp, 300 ul TEN-Buffer ekleyin ve tüm inkübe 4 ° C rotator geceleme. Kalan sıvı aspire etiketli toplama tüpü, daha önce olduğu gibi aktarmak ve toplam kurtarılan hacmi not edin. f. Etanol Yağış Oda sıcaklığında% 100 etanol 3 cilt ekleyin. 0.5 ul Glikojen (20 mg / ml) ekleyin. Vorteks. Kuru buz üzerinde en az 2 saat veya -80 ° C gece inkübe edin. 4 ° C'de 30 dakika boyunca pelet cDNA mikrosantrifüj içinde dönmeye. Sıvı dökümü, 700 ul oda sıcaklığında 10 dakika boyunca% 75 etanol ve spin ekleyin. Sıvı dökümü ve 5 dakika için tekrar döndürün. 10 dakika boyunca pelet ve kuru hava bozmadan süpernatant emmek. Temiz su pelet çözülür. Not: İstenen hacim konsantre cDNA Çözüm, deneysel tasarım bağımlı ve kontrol deneyleri içermelidir . 7. Pre-PCR Ürün saflaştırılması Astar enzimatik sindirim Arıtma (üretmektedir protokoller sonrasında spin kolon) Reaktifin Adı Şirket / Cat eşya # ExoSAP-IT USB-Affymetrix 78250 MinElute PCR Arıtma Kiti Qiagen 28004 Not: bizim elimizde özel enzimatik temizleme başarıyla kaldırıldı primerler da sıcaklık 80 ° C inaktivasyonu adım sırasında yükselir kısa ürünlerin denatüre muhtemelen nedeniyle kısmi ön amplifiye ürün kısmi bozulma açtı ama. enzim. Isı inaktivasyonu kaçınmak ve doğrudan dönüş sütunlarını kullanarak enzimatik reaksiyon PCR ürünleri arındırıcı ürün bozulma olmadan herhangi bir astar kaldırır. 2 ul ExoSAP-IT ile 5 ul-PCR sonrası ürün karıştırın. 37 ° C'de 15 dakika kalan astar ve nükleotidlerin aşağılamak için. PB Tampon eklenmiştir pH göstergesi durumunda, PCR reaksiyonu ve mix 1 hacim Tampon PB 5 birimleri karışımı rengi sarı olup olmadığını kontrol edin. 2 ml toplama tüpü MinElute sütun uygun bir rafa yerleştirin. 1 dakika için MinElute bir sütun ve santrifüj için örnek uygulayın. Flow-through atın, aynı tüpe geri MinElute sütun ve 1 dakika boyunca yıkayın ve santrifüj 750 ul Tampon PE MinElute sütun ekleyin. Flow-through atın ve aynı tüp MinElute sütun yerine geri. Maksimum hızda 1 dakika için ek bir sütun santrifüjleyin. Temiz bir 1.5 ml mikrosantrifüj tüp MinElute sütuna yerleştirin. DNA Zehir, cen sonra, membran merkezine 10 ul DEPC arıtılmış su eklemek sütun, 1 dakika boyunca bekletin ve1 dakika için trifuge. 8. Fludigim 96,96 QRT-PCR Profilleme Reaktifin Adı Şirket / Cat eşya # Yorumlar Fluidigm 96,96 Dinamik Dizi Seti 96,96 dinamik bir dizi 96,96 kontrolü hattı sıvısı 20x Yükleniyor Reaktif Fluidigm Corporation'ın Mix Evrensel Ters Primer (1 mcM) İleri Primer (1 mcM) TaqMan Probe (0.2 mcM) Integrated DNA Technologies Özel Seri çekim (1) 2x Evrensel PCR Master Mix NoAmpErase UNG Applied Biosystems 4324018 Tween 1. Astar 96,96 Dinamik Dizi IFC Her birine çip üzerinde akümülatörlerin kontrolü hattı sıvısı (150 ul) enjekte edilir. IFC (entegre akışkan devresi) denetleyicisi yonga ve yonga içine asal kontrol hattı sıvı Başbakan (136x) komut dosyası çalıştırın. Not: Chip paket açıldıktan sonra 24 saat kullanılması gerekir. Çip veya girişler kontrol hattı sıvı çip kullanılamaz hale getirir bu yana kontrol hattı sıvı dökmemeye emin olun. Chip emişli 60 dakika içinde yüklü olması gerekiyor. 2. Numunelerin hazırlanması 2.1 Ön-Numune Hazırlama Tek bir plastik tüp, örnek Ön-Mix (giriş için birimler) yapmak için aşağıdaki tabloyu bileşenleri birleştirir. 2x TaqMan Evrensel Master Mix 2.5 ul 20x Yükleniyor Reaktif 0.25 ul Not: Final Cilt, 2.75 ul pipet için geçkin kayıpları vazgeçmek gibi 2.2 Örnek-Hazırlık 96 birleştirin ön-örnek karışımı (giriş için cilt) ile her bir örnek biçimi. Ön-Örnek-Mix 2.75 ul Örnek 2.25 ul Not: kısaca sıvı toplamak için Vortex ve santrifüj 96 plaka. Final Hacim, giriş 5 ul başına biraz daha yüksek hacim hazırlarken dikkate kaybı pipetleme alır. 2.3 13x Tahliller hazırlanması 96 plaka, 13x testleri hazırlamak için kullanın. Aşağıdaki tabloda, 13x 1x konsantrasyonları büyütmek. Evrensel Ters Astar 1 mikron (1x) 2 sırası İleri Astar * 1 mikron (1x) * Gen-özel TaqMan Probe # 0.2 mikron # * Ileri primerler listesi bulunabilir http://urology.ucsf.edu/blellochlab/protocols.htm TaqMan Problar Listesi bulunabilir http://urology.ucsf.edu/blellochlab/protocols.htm % 0.25 son Tween konsantrasyon için, Tween ile 13x deneyleri yeni bir 96 plaka alikotları Birleştirin Not: giriş ortalama Final Cilt ses aktarımı sırasında kaybı dikkate almak için yeterli hacmi (5.5 ul) hazırlamak, 5 ul. Iyice karıştırınız kabarcıkları kaçınarak ve sıvı toplamak için kısaca santrifüj. 3. Yükleme çip Not: örnekler ve testlerin çip doğru konumlandırma sağlamak doğru yükleme için izin için. Sol üst köşesine çentik hizalamak için uygundur. Tüm tahlil sağlanması ve örnek çözümler çip yüklemeden önce karıştırılır. 96 plaka bunu ve çip yüklemeden önce plaka spin uygundur. Daha sonra başvurmak için çip pipetleme harita farkında olun. Kullanılmayan örnek girişler 2.75 ul örnek Mix ve 2.25 ul DNA serbest su ile doldurulmalıdır. Kullanılmayan tahlil girişler 2.5 ul tahlil yükleme reaktif ve 2.5 ul su ile doldurulmalıdır. Hava kabarcıkları almaktan kaçınması pipetleme ise ilk durağı geçmiş gitmeyin. Yükledikten sonra örnekleri ve testleri (Vgiriş için olume: 5 ul) Yük Mix komut dosyası (136x) komut dosyası örnekleri ve testlerin çip içine yüklemek için çalıştırın. Script bittikten sonra, ICF denetleyicisi yonga çıkarın. Yüklenen çip alt mavi koruyucu film Peel. Çip yüzeyine herhangi bir toz parçacıkları veya enkaz çıkarın. 4. 96,96 QRT-PCR BioMark sistem çip transfer ve aşağıdaki amplifikasyon koşulları: 55 ° C 2 dk, 95 ° C, 10 dakika, 15 s ve 1 dakika boyunca 55 ° C – 95 ° C 40 döngü ile takip. Yazılım veri toplama için üretim protokolü uygulayın. 5. QPCR analiz yazılımı kullanma RT-PCR sonra sahipli yazılım, her bir kuyu için amplifikasyon eğrileri, ısı haritaları ve Ct değerlerini sağlar. Veri analizi için yazılım kılavuzuna başvurun. 9 – Temsilcisi Sonuçlar: Şekil 1. Deneysel iş akışının şematik bir gösterimi. Gösterilen multipleks QRT-PCR protokolü bir adım-adım açıklama, önce aşırı primerlerin multipleks ters transkripsiyon (Adım C) ve multipleks amplifikasyon arıtma (Adım D) (D Step) de dahil olmak üzere gerçek zamanlı algılama (Adım F), QRT-PCR için cDNA şablon saflaştırılmış. FP: microRNA özgü ileri astar, URP: Evrensel ters astar, Ar-SLP: microRNA özgü ters kök döngü astar. Daha büyük bir görüntü için buraya tıklayın. Şekil 2. Polyacryamide jel arıtma pre-PCR ürününün boyutu ön-PCR Gruplar sonra Mah-PCR şablonu sadece WT örnekleri görüldüğü gibi, değil microRNA eksik DGCR8 / veya Dicer / – örnekleri (oklar) sonra 96-plex RT ve 12 döngüleri amplifikasyon. Tüm örnekler (yıldız), bilinmeyen (ok başları) ve aşırı primerler non-spesifik ürünler olduğunu unutmayın. Şekil 3. Arıtma multipleks amplifikasyon sonra Mah-PCR sonuçlarının doğruluğunu büyük ölçüde geliştirir a) WT Mesc göreceli ekspresyon düzeyleri Karşılaştırma Dgcr8 – / – (kanonik microRNA eksik) Mesc daha microRNA 1) algılama ve 2) yalancı pozitif kaybı ortaya ön-PCR ürünü primerler arındırıcı sonra arka planlar – / – Dgcr8 sinyaller. b) arıtma sonra, her iki DGCR8 göreceli ekspresyon düzeyleri – / – / WT ve Dicer – / – / WT yanlış pozitif sinyaller kaybı ve nadir Dgcr8 bağımsız / Dicer bağımlı küçük RNA'lar (MIR-320, uygun kategorize izin – 484, -877) 5 Şekil 4. Fluidigm yüksek verimli QRT-PCR miRNA profilleme Örnek ekran prostat kanseri hasta serumlarının miRNA düzeyleri değişiklik için ekrana 96,96 Fluidigm QRT-PCR mircoRNA profil vurdu. Gerçek zamanlı qPCR analiz yazılımı amplifikasyon eğrileri, renk kodlu ısı haritalar ve bisiklet eşiği (Ct) sağlar.