Высокая профилирования микроРНК Производительность: Оптимизированная Мультиплекс QRT-PCR на шкале Nanoliter на Fluidigm Динамический МФХБ ArrayTM

1. РНК-Добыча: клетки, выращенные в монослоя (Следуя протоколу производителя, используя TRIzol.) Название реагента Компания Prod / Cat # Решение TRIzol Invitrogen 15596-018 Изопропиловый спирт Sigma-Aldrich 1907-64 Хлороформ Sigma-Aldrich C 2432 Этанол РНКазы свободной воды Гомогенизация Однородный клетки непосредственно на культуру блюдо, добавляя 1 мл Trizol Решение на 10 см 2 блюдо область, вихрем Trizol вокруг и пипетку вверх и вниз, чтобы обеспечить полный охват пластины. Разделение фаз Инкубируйте гомогенизированный образец в течение 5 минут при комнатной температуре. Перевод на помечены трубки, добавляют 0,2 мл хлороформа на 1 мл TrizolSolution и трясти трубку энергично вручную в течение 15 секунд. Инкубируйте при комнатной температуре в течение 3 минут. Центрифуга образца при 12 000 мкг в течение 15 минут при температуре +2 ° C. После центрифугирования смесь разделяется на нижней красной фазы, межфазного и бесцветной верхней водной фазы, которая содержит РНК, а должна быть 60% от общего объема Trizol решение. РНК осадков Передача водных, РНК, содержащие фазы в свежем, помечены трубки. Осадок РНК путем добавления 0,5 мл изопропилового спирта на 1 мл Trizol решение. Инкубируйте образцы при комнатной температуре в течение 10 минут. Центрифуга при 12000 мкг в течение 10 минут при температуре +2 ° C. РНК-мыть После центрифугирования супернатант отказаться от труб. Вымойте РНК гранул (на боковой и нижней части трубки), добавив по крайней мере 1 мл 75% этанола на 1 мл Trizol решений вихря. Центрифуга при 7500 мкг в течение 5 минут при температуре +2 ° C. РНК Элюирование Удалите супернатант и центрифуга снова в течение 1 минуты. Удалить чрезмерной жидкости. Высушите гранул в течение 5-10 минут. Примечание: пересушенными РНК трудно растворить. Растворится осадок в РНКазы свободной воды с помощью пипетки раствор вверх и вниз и выдержать в течение 10 минут при 55 ° C. Мера РНК концентрации (A260/280 соотношение), используя спектрофотометр Nanodrop ™. Хранить при температуре -80 ° С до готовности к использованию. 2. РНК-Добыча: сыворотка (Протокол После mirVana ПАРИЖ Kit производителя модифицированных Митчелл и др. 1.) Название реагента Компания Prod / Cat # Комментарии мир Вана ПАРИЖ Kit 2X денатурирующих решения Кислотно-фенол: хлороформ микроРНК промывочного раствора 1 микроРНК промывочного раствора 2 / 3 Амбион AM1556 Измененный протокол 2-меркаптоэтанол Sigma-Aldrich M7522 Этанол DEPC очищенной воды Химическая подготовка: Добавить 375 мкл 2-меркаптоэтанола к 2X денатурирующих решения и хорошо перемешать. Добавить 21 мл 100% этанола Решение микроРНК мыть 1. Добавить 40 мл 100% этанола Решение микроРНК мыть 2 / 3. Подготовка образцов: Оттепель образца сыворотки на льду. Гомогенизация Смешайте 300 мкл образца с равным объемом (300 мкл) 2X денатурирующих Решение (должна быть комнатной температуры) и вихрь. Выдержите смесь на льду в течение 5 минут. Добавить объема кислотно-фенол: хлороформ равно общий объем лизата образца плюс 2X денатурирующих Решение (600 мкл). Важно: не используйте водный буфер, который лежит на вершине кислотно-фенол: хлороформ. Vortex смеси в течение 60 секунд. Центрифуга при комнатной температуре в течение 15 минут при максимальной скорости (> 10 000 мкг). После центрифугирования смесь разделяется на верхнюю водную фазу, интерфазе и нижней органическую фазу. Удалить aqueПодразделения слой (должно быть 300 – 500 мкл в том числе любые proteinacious "туманный" слой). Re-экстракт водный слой как и прежде, снова добавить хлороформ. Важно: водный слой второго извлечения обычно меньше по объему (250 мкл). Обратите внимание на объем восстановлены. Подготовка окончательного РНК-изоляции (общая РНК) Разогреть (95 ° С), нуклеазы без воды. 100% этанола должна быть комнатной температуры. Заключительные РНК-изоляции (общая РНК) Добавить 1,25 объемами 100% этанола, восстановленные водной фазы (например, если 300 мкл был восстановлен, добавьте 375 мкл этанола) и тщательно перемешать. Для каждого образца, место сменный фильтр в одном из коллекции трубок. Внесите лизата на фильтре. Центрифуга (10000 мкг) в течение 30 секунд, отказаться от проточных, центрифуга снова в течение 30 секунд и замену фильтра в ту же трубку коллекции. РНК-Wash Применить 700 мкл промывочного раствора микроРНК 1 до фильтра и центрифуги в течение 15 секунд, отбросить проточные из пробирки, и заменить сменный фильтр в той же пробирке коллекции. Применить 500 мкл промывочного раствора микроРНК 2 / 3, центрифуги в течение 15 секунд, отбросить проточные и повторите со второй 500 мкл промывочного раствора 2 / 3. Откажитесь от проточных и сухая спина в течение 1-2 минут. Место фильтр в новую пробирку сбора, применяются 100 мкл РНКазы свободной воды (95 ° C), закрыть крышкой и выдержать в течение 2 минут. Центрифуга для ~ 2 минуты, чтобы восстановить РНК. Хранить при температуре -80 ° С до использования. 3. Концентрация РНК-Solution (5X) (После протокол завода-изготовителя) Название реагента Компания Prod / Cat # Микроконтроллер центробежный фильтр устройства, Ultracell YM-3 Millipore 42404 DEPC очищенной воды Устройство: микроконтроллер Ultracell YM-3, Cutoff СС и DS Нуклеотиды: 10 Объем: Желаемый объем повторного концентрированный раствор РНК зависит от опытно-конструкторских и должны включать в себя контрольные эксперименты. Вставьте резервуар микроконтроллер образца в пузырек и пипетку раствор в резервуар. Примечание: Не прикасайтесь к мембране. Центрифуга для 185 минут при 4 ° С с максимальным 14000 х g. Примечание: Позиция флакон с трещиной группы по отношению к ротору. Внесите желаемые объем воды РНКазы бесплатно (например, 20 мкл) на водохранилище, водохранилище место перевернутый в новый флакон и спина в течение 3 минут при 4 ° С с максимальным 3000 х г. Хранить при температуре -80 ° С до использования. 4. Обратной транскрипции (Следуя протоколу Tang и соавт. 2 с изменениями.) Название реагента Компания Prod / Cat # Комментарии Высокая производительность кДНК комплект архива 10x кДНК архивирования буфера дНТФ (100 мм) Молони мышиного вируса лейкоза (MMLV) обратной транскриптазы (50 ед / мкл) Applied Biosystems 4368814 модифицированный протокол RNaseOUT (40 ед / мкл) Invitrogen 10777019 х-Plex обратном стволовых петля грунтовки смеси (40 нм) * Комплексная ДНК-технологий Обычай Последовательности * DEPC очищенной воды Реакция Объем: 5,5 мкл Примечание: конечная концентрация стволовых петля грунтовки должна быть 1-5 нм (здесь 2 нм). Подготовка мастер-Mix (тома на реакцию) следующим образом: 1. DEPC по водным ресурсам 1,959 мкл 2. 10x RT-буфера 0,55 мкл 3. Ингибитор РНКазы (40 ед / мкл) 0,0715 мкл 4. дНТФ (100 мм) 0,275 мкл 5. х-Plex обратном стволовых петля грунтовки смеси (40 нм) * 0,275 мкл 6. MMLV-RT (50 ед / мкл) 0,369 мкл Мих и центрифуги кратко. Добавить 3,5 мкл мастер-Mix по 2 мкл образца. Выполните следующие RT-реакции: 16 ° С в течение 30 минут, затем 60 циклов при 20 ° С в течение 30 секунд, 42 ° С в течение 30 секунд, 50 ° С в течение 1 секунды и, наконец, 85 ° C в течение 5 минут для инактивации MMLV-РТ, 4 ° C ∞ . Хранить при температуре от -20 ° C до использования. * Список обратном стволовых петля грунтовки можно найти на http://urology.ucsf.edu/blellochlab/protocols.htm 5. Предварительного усиления (Pre-ПЦР) (Следуя протоколу Tang и соавт. 2 с изменениями.) Название реагента Компания Prod / Cat # Комментарии дНТФ (100 мм) Applied Biosystems 4368814 Высокие шапки. кДНК Kit архива. 2x Универсальная PCR Master Mix с NoAmpErase УНГ Applied Biosystems 4324018 х-Plex прямого праймера смеси (450 нм) * Комплексная ДНК-технологий Обычай Последовательности * Универсальный обратный праймер (100 мкМ) Комплексная ДНК-технологий Обычай Последовательность 2 AmpliTaqGold полимераза (5 ед / мкл) Applied Biosystems 4311806 MgCl 2 (100 мМ) DEPC очищенной воды Реакция Объем: 27.5μl (22μl ММ + 5.5μl RT-продукт) Примечание: Предварительно Усиление необходимо повысить уровень сигнала, особенно при исходной концентрации РНК ограничено. Входной уровень РНК определяет оптимальное количество Предварительно циклов ПЦР. Учитывая же относительной эффективности каждого цикла ПЦР следует удвоить концентрацию конечного продукта. Так как некоторые микроРНК будет более высоко выражена, избегать чрезмерной езды на велосипеде. Однако, согласно усиления может привести к потере чувствительности обнаружения, особенно для микроРНК, высказанные на низком уровне. В наших руках 12 предварительно циклов амплификации, используя 100ng суммарной РНК, появилось достаточно. Использование сыворотки в качестве исходного материала, 12 циклов приводит к обнаружению уровней микроРНК, но 15 циклов оказалась превосходной. Наконец, начиная с 3 ооцитов (примерно 400 пг полной РНК в яйцеклетку 3), 16 предварительного усиления циклов успешно позволило нам для выявления микроРНК уровни экспрессии 4. * Список вперед грунтовки можно найти на http://urology.ucsf.edu/blellochlab/protocols.htm Подготовка мастер-Mix (тома на реакцию) следующим образом: 1. 2x Универсальный ММ 13,75 мкл 2. DEPC по водным ресурсам 0,792 мкл 3. MgCl 2 (100 мМ) 0,55 мкл 4. дНТФ (100 мм) 1,1 мкл 5. х-Plex прямого праймера смеси (450 нм) 3,06 мкл 6. Универсальный RP (100 мкМ) 1,375 мкл 7. AmpliTaqGold полимераза (5 ед / мкл) 1,375 мкл Смешайте и центрифуги кратко. Добавить 22 мкл мастер-Mix для каждого 5,5 мкл RT-Продукт. Выполните следующие Предварительно ПЦР-реакции: 95 ° C в течение 10 мин, 55 ° С в течение 2 мин, затем 10 – 18 циклов 95 ° С в течение 1 с и 65 ° С в течение 1 мин, 4 ° C ∞. 6. Очистка Предварительно ПЦР продукта Очистка выбора размера на 10% родной полиакриламидном геле Название реагента Компания Prod / Cat # 40% Акриламид / бис решения Bio-Rad 161-0144 TEMED Bio-Rad 161-0801 10 пар оснований ДНК, лестницы Invitrogen 10821-015 SYBR Золотой нуклеиновых кислот гель пятно 10000 X концентрата в ДМСО Invitrogen S11494 Гликоген (20 мг / мл) Roche 10 901 393 001 Буфер-EB 10% Ammoniumpersulfate (APS) TEN-буфера 6x Оранжевый G DEPC очищенной воды ddH2O a. Гель подготовка Для того, чтобы 10 мл 10%-ном полиакриламидном смесь добавить 1. DDH 2 O 6,5 мл 2. 10x КЭ 1 мл 3. Полиакриламида (40%) 2,5 мл 4. APS (10%) 80 мкл 5. TEMED 4 мкл Подготовка ДНК лестнице: 0,5 мкл 10 пар оснований ДНК, лестницы 4,5 мкл буфера (EB) 1 мкл 6x Оранжевый G Добавить 5,5 мкл 6x Оранжевый G каждому 27,5 мкл Предварительно ПЦР продукта. b. Выполнить Гель Выполнить Гель с 150V на 55-60 минут. Примечание: бромфенола синий индикатор, как работает с 20bp регионе. c. Пятно Гель Пятно гель с SYBR-Gold в течение 25 минут на шейкере. Примечание: SYBR-Gold является светочувствительным. d. Вырезать Гель Вырежьте Предварительно продукт ПЦР-группа из 60-80 б.п. и передачи меченых трубки. Примечание: группа низкого входного РНК Предварительно продуктов ПЦР может быть не видна. Давка гель группы (например, труба в трубе центрифугирования). e. Повторное извлечение кДНК Добавить 300 мкл TEN-буфера и инкубировать при 37 ° С в течение 4 часов на ротатора. Передача жидкости помечены пробирку, добавить еще 300 мкл TEN-буфера для геля содержащих трубки, инкубировать всего на 4 ° С в течение ночи на ротатора. Аспирируйте оставшуюся жидкость, трансфер помечены коллекции трубку, как до, так и отметить полное восстановление объема. f. Этанол осадков Добавить 3-х томах комнатной температуры 100% этанола. Добавить 0,5 мкл Гликоген (20 мг / мл). Vortex. Инкубировать на сухом льду как минимум на 2 часа или при -80 ° С в течение ночи. Спина в микроцентрифужных при 4 ° С в течение 30 минут для осаждения кДНК. Дамп жидкость, добавьте 700 мкл температура в помещении 75% этанола и спина в течение 10 минут. Дамп жидкости и спин снова в течение 5 минут. Отсасывать супернатант, не нарушая гранул и сухой воздух в течение 10 минут. Растворяться гранул в чистой воде. Примечание: Желаемый объем концентрированного кДНК Решение зависит от опытно-конструкторских и должны включать в себя контрольные эксперименты. 7. Очистка Предварительно ПЦР продукта Очистка ферментативного переваривания грунтовки затем спина колонке (следующие производит протоколов) Название реагента Компания Prod / Cat # ExoSAP-IT USB-Affymetrix 78250 MinElute ПЦР Очистка Kit Qiagen 28004 Примечание: В наших руках эксклюзивный ферментативной очистки успешно удален грунтовки, но и привело к частичной деградации предварительно усиливается продукт, возможно, связано с частичной денатурации-за короткого продукты, как температура поднимается до 80 ° С в течение инактивации шаг фермента. Как избежать инактивации тепла и непосредственно очистки продуктов ПЦР с использованием ферментативной реакции спина столбцов удаляет любые грунтовка без деградации продукта. Смешайте 5 мкл пост-ПЦР-продукта с 2 мкл ExoSAP-IT. Инкубировать при 37 ° С в течение 15 минут, чтобы ухудшить оставшихся праймеров и нуклеотидов. Добавьте 5 объемами буфера PB до 1 объема реакции ПЦР и перемешать, если рН индикатор Я был добавлен в буфер PB, убедитесь, что цвет смесь желтого цвета. Место MinElute столбца в условии 2 трубки коллекция мл в стойку. Применить образца MinElute колонны и центрифуги в течение 1 минуты. Отменить проточный, место MinElute колонке обратно в эту же трубку и добавить 750 мкл буфера для PE MinElute колонке мыть и центрифуги в течение 1 минуты. Отменить проточные и место MinElute назад столбец в той же трубе. Центрифуга колонку еще на 1 минуту при максимальной скорости. Место MinElute колонку в чистую 1,5 трубки микроцентрифужных мл. Для элюции ДНК, добавить 10 мкл DEPC очищенной воды в центре мембраны, пусть колонки стоять в течение 1 минуты, а затем центрtrifuge течение 1 минуты. 8. Fludigim 96,96 QRT-PCR профилирования Название реагента Компания Prod / Cat # Комментарии Fluidigm 96,96 динамического массива Kit 96,96 динамический массив 96,96 контрольной линии жидкости 20x Загрузка реагентов Fluidigm корпорации Смесь Универсальный обратный праймер (1 мкМ) Форвард Primer (1 мкМ) TaqMan зондов (0,2 мкм) Комплексная ДНК-технологий Обычай Последовательность (1) 2x Универсальная PCR Master Mix с NoAmpErase УНГ Applied Biosystems 4324018 Tween 1. Грунтовка 96,96 динамического массива МФК Inject контрольной линии жидкость (150 мкл) в каждую из аккумуляторов на чипе. Место чип в МФК (встроенный жидкостный контур) контроллера и запустить Prime (136x) сценарий премьер жидкости линии контроля в чипе. Примечание: Чип должен использоваться через 24 часа после открытия упаковки. Убедитесь в том, чтобы не пролить жидкость линии управления с контролем линии жидкости на чипе или в бухтах делает чип из строя. Чип должен быть загружен в течение 60 минут грунтования. 2. Подготовка образцов 2,1 Предварительно пробоподготовки В одноразовую пластиковую трубку, объединить компоненты в таблице ниже, чтобы Пример-Pre-Mix (тома на входе). 2x TaqMan Универсальный Master Mix 2,5 мкл 20x Загрузка реагентов 0,25 мкл Примечание: Конечный объем 2,75 мкл, а излишки для пипетки обойтись без потерь 2,2 пробоподготовки Комбинат в 96 и формат каждого образца с предварительно образец смеси (объемы на входе). Предварительно Sample-Mix 2,75 мкл Образец 2,25 мкл Примечание: Vortex и центрифуги 96 ячейках кратко для сбора жидкости. Конечный объем на входе 5 мкл, взять пипеткой потери во внимание, подготовив несколько выше объема. 2.3 Подготовка 13x Анализы Использование 96-луночный планшет для подготовки 13x анализов. 1x концентрации в таблице ниже, расширить для 13x. Универсальный обратный праймер 1 мкм (1x) Последовательность в 2 Форвард * Primer 1 мкм (1x) * Гена конкретных TaqMan зондов # 0,2 мкм # * Список вперед грунтовки можно найти на http://urology.ucsf.edu/blellochlab/protocols.htm # Список Зонды TaqMan можно найти на http://urology.ucsf.edu/blellochlab/protocols.htm Комбинат в новом 96-аликвоты пластины 13x анализов с твин на 0,25% конечной концентрации Твин Примечание: Окончательный объем на входе 5 мкл, подготовить достаточный объем (5,5 мкл) принять потери во время объем передачи во внимание. Тщательно перемешать, избегая пузырьков и кратко центрифуги для сбора жидкости. 3. Загрузка чип Примечание: Для того чтобы правильно загрузки проб и анализов обеспечить правильное расположение чипов. Это удобно для выравнивания выемка в левом верхнем углу. Убедитесь, что все пробы и образцы решений смешиваются перед загрузкой чипа. Это удобно сделать это в 96 ячейках и спина тарелку перед загрузкой чипа. Будьте в курсе чип пипетирования карту для дальнейшего использования. Неиспользуемые входы образца должны быть заполнены 2,75 мкл Смешать образца и 2,25 мкл ДНК свободной воды. Неиспользуемые входы анализа должны быть заполнены 2,5 мкл реагента загрузки теста и 2,5 мкл воды. Не пройдите мимо первой остановкой в ​​то время как пипетки, чтобы избежать введения пузырьков воздуха. После загрузки образцов и анализов (Volume на входе: 5 мкл) запустить скрипт нагрузки Mix (136x) скрипт для загрузки образцов и анализов в чип. После того как сценарий завершится, удалить чип контроллера МКФ. Пил синий защитную пленку с нижней стороны загружены чип. Удалите все частицы пыли и мусора с поверхности чипа. 4. 96,96 QRT-PCR Передача чип системы BioMark и использование следующих условиях усиления: 55 ° С в течение 2 мин, 95 ° С в течение 10 мин, затем 40 циклов 95 ° C в течение 15 с и 55 ° С в течение 1 мин. Следуйте протоколу производства для сбора данных, программное обеспечение. 5. Использование программного обеспечения КПЦР анализ После RT-PCR проприетарное программное обеспечение обеспечивает усиление кривых, тепло карты и Ct значения для каждой скважины. Пожалуйста, обратитесь к руководство по программному обеспечению для анализа данных. 9. Представитель Результаты: Рисунок 1. Схематическое изображение экспериментальной рабочий процесс. Показана шаг за шагом, описание мультиплекс QRT-PCR протокола, в том числе очистка (этап Е) чрезмерной грунтовки от мультиплекс обратной транскрипции (шаг С) и мультиплекс предварительного усиления (шаг D) до реального времени обнаружения (шаг F), в результате чего очищенная кДНК шаблон для QRT-PCR. FP: микроРНК конкретных прямого праймера, УРП: универсальная грунтовка обратном, R-SLP: микроРНК конкретных обратном стволовых петля грунт. Нажмите здесь, чтобы увеличить картинку. Рисунок 2. . Polyacryamide очистки гель QRT-PCR шаблон после предварительной ПЦР Полосы предварительно ПЦР размер продукта являются исключительно видели в WT образцы, но не в микроРНК недостаточно Dgcr8 – / – или Dicer – / – образцы (стрелки), после 96-сложных РТ и 12 циклов предварительного усиления. Обратите внимание, что неспецифические продукты неизвестного происхождения (наконечники стрел) и чрезмерное грунтовки можно найти во всех образцах (звезд). Рисунок 3. Очистка после мультиплекс предусиления значительно улучшает точность QRT-PCR результаты) Сравнение относительного уровня экспрессии WT мЭСК к Dgcr8 -. / – (Канонической микроРНК недостаточным) мЭСК показывает, 1) выявление более микроРНК и 2) потеря ложных срабатываний сигналов в Dgcr8 – / – фон после очистки от праймеров предварительно ПЦР продукта. б) После очистки, относительные уровни экспрессии как Dgcr8 – / – / WT и Dicer – / – / WT-шоу потери ложных положительных сигналов и обеспечения надлежащего категоризации редких Dgcr8 независимые / Dicer зависимыми малых РНК (MIR-320, – 484, -877) 5. Рисунок 4. Fluidigm высокой пропускной QRT-PCR микроРНК профилирования. Пример скриншот 96,96 Fluidigm QRT-PCR профилирования mircoRNA для выявления изменений в микроРНК уровней простаты сыворотки пациента рак. В режиме реального времени КПЦР программного обеспечения для анализа обеспечивает усиление кривые, цветные карты тепла и цикл порогом (КТ).