1. ARN-Extraction: cellules cultivées en monocouche (Selon le protocole du fabricant en utilisant TRIzol.) Nom du réactif Société Prod / Cat # Solution TRIzol Invitrogen 15596-018 L'alcool isopropylique Sigma-Aldrich 1907-1964 Chloroforme Sigma-Aldrich C 2432 Éthanol RNAse l'eau Homogénéisation Homogénéiser les cellules directement sur la boîte de culture en ajoutant 1 ml de solution par 10 Trizol espace plat cm 2, tourbillonner le Trizol autour et pipettes haut et bas pour assurer une couverture complète de la plaque. Séparation de phase Incuber l'échantillon homogénéisé pendant 5 minutes à température ambiante. Transférer dans un tube étiqueté, ajoutez 0,2 ml de chloroforme par 1ml TrizolSolution et secouer le tube vigoureusement à la main pendant 15 secondes. Incuber à température ambiante pendant 3 minutes. Centrifuger l'échantillon à 12 000 xg pendant 15 minutes à 2 ° C. Après centrifugation, le mélange se sépare en une phase inférieure rouge, une interphase et une phase aqueuse supérieure incolore, qui contient l'ARN et devrait être de 60% du volume total de solution Trizol. Précipitations ARN Transférer la solution aqueuse, contenant l'ARN dans une phase de frais, tube étiqueté. Précipiter l'ARN en ajoutant 0,5 ml d'alcool isopropylique pour 1 ml de solution de Trizol. Incuber les échantillons à température ambiante pendant 10 minutes. Centrifuger à 12000 xg pendant 10 minutes à 2 ° C. ARN-wash Après la centrifugation, éliminer le surnageant des tubes. Laver le culot d'ARN (sur le côté et au fond du tube) en ajoutant au moins 1 ml d'éthanol à 75% pour 1 ml de solution Trizol, vortex. Centrifuger à 7500 xg pendant 5 minutes à 2 ° C. ARN élution Jeter le surnageant et centrifuger à nouveau pendant 1 minute. Retirer excessive de liquide. Air culot sec pendant 5-10 minutes. Remarque: plus secs ARN est difficile à solubiliser. Reprendre le culot dans l'eau libre de RNase par pipetage la solution haut et le bas et incuber pendant 10 minutes à 55 ° C. Mesurer la concentration d'ARN (A260/280 ratio) à l'aide d'un spectrophotomètre ™ Nanodrop. Conserver à -80 ° C jusqu'à utilisation. 2. ARN-Extraction: Sérum (Protocole suivant Mirvana PARIS Kit fabricant modifié par Mitchell et al. 1) Nom du réactif Société Prod / Cat # Commentaires mir Vana PARIS Kit 2X solution dénaturante Acide-phénol: chloroforme Solution de lavage 1 miARN Solution de lavage miARN 2 / 3 Ambion AM1556 Mis à jour le protocole de 2-mercaptoéthanol Sigma-Aldrich M7522 Éthanol DEPC eau traitée Préparation chimique: Ajouter 375 ul de 2-mercaptoéthanol à la solution 2X dénaturation et bien mélanger. Ajouter 21 ml d'éthanol à 100% à la solution de lavage miARN 1. Ajouter 40 ml d'éthanol à 100% à la solution de lavage miARN 2 / 3. Préparation des échantillons: Dégel échantillon de sérum sur la glace. Homogénéisation Mélanger 300 échantillons ul avec un volume égal (300 pi) de solution dénaturante 2X (doit être à température ambiante) et vortex. Incuber le mélange sur la glace pendant 5 minutes. Ajouter un volume d'acide-phénol: chloroforme égal au volume total de l'échantillon plus lysat la solution 2X dénaturant (600 pi). Important: Ne PAS utiliser le tampon aqueuse qui se trouve sur le dessus de l'équilibre acide-phénol: chloroforme. Mélange Vortex pendant 60 secondes. Centrifuger à température ambiante pendant 15 minutes à vitesse maximale (> 10 000 xg). Après centrifugation, le mélange se sépare en une phase aqueuse supérieure, une interphase et une phase organique inférieure. Retirer Aquecouche des unités d'organisation sur le dessus (qui devrait être de 300 à 500 ul y compris toute proteinacious "flou" couche). Re-extrait de la couche aqueuse comme avant par ajoutant encore chloroforme. Important: La couche aqueuse de la deuxième extraction est systématiquement plus petit en volume (250 pi). Noter le volume récupéré. Préparation de l'ARN-finale Isolement (ARN total) Pré-chaleur (95 ° C) eau sans nucléase. L'éthanol à 100% doit être à température ambiante. Finale ARN-Isolation (ARN total) Ajouter 1,25 volumes d'éthanol 100% à la phase aqueuse récupérée (par exemple, si 300 ul a été récupérée, ajouter 375 ul d'éthanol) et bien mélanger. Pour chaque échantillon, placer un filtre à cartouche dans l'un des tubes de prélèvement. Pipeter le lysat sur le filtre. Centrifugeuse (10.000 xg) pendant 30 secondes, jeter le flux continu, centrifuger à nouveau pendant 30 secondes et remplacer le filtre à cartouche dans le tube même collection. ARN-Wash Appliquer la solution 700 ul Laver miARN 1 à la cartouche filtrante et centrifuger pendant 15 secondes, jeter le flux continu du tube de collecte, et de remplacer la cartouche filtrante dans le tube même collection. Appliquer 500 ul Solution Laver miARN 2 / 3, centrifuger pendant 15 secondes, jeter le flux continu et de répéter avec un second 500 pi de solution de lavage 2 / 3. Jeter l'effluent à travers et sèche-spin pendant 1-2 minutes. Placez la cartouche de filtre dans un tube de collection fraîche, appliquer 100 ul RNAse eau (95 ° C), bouchon de fermer et laisser incuber pendant 2 minutes. Centrifuger pendant ~ 2 minutes pour récupérer l'ARN. Conserver à -80 ° C jusqu'à utilisation. 3. Concentration de l'ARN-Solution (5X) (Suivant le protocole du fabricant) Nom du réactif Société Prod / Cat # MICROCON centrifuge dispositifs de filtrage, Ultracell YM-3 Millipore 42404 DEPC eau traitée Périphérique: Microcon Ultracell YM-3, coupure SS et des nucléotides DS: 10 Volume: volume désiré de ré-solution concentrée ARN dépend de la conception expérimentale et devrait inclure des expériences de contrôle. Insérez réservoir de l'échantillon dans le flacon Microcon et la solution la pipette dans le réservoir. Note: Ne pas toucher la membrane. Centrifuger pendant 185 minutes à 4 ° C avec 14 000 x g. maximale Remarque: flacon de position avec la bande de crack vers le rotor. Pipeter le volume désiré de RNAse eau (par exemple 20 ul) sur le réservoir, le réservoir lieu inversé dans un nouveau flacon et de spin de 3 minutes à 4 ° C avec G. maximale x 3000 Conserver à -80 ° C jusqu'à utilisation. 4. Reverse Transcription (Suite à un protocole par Tang et al. 2 avec des modifications.) Nom du réactif Société Prod / Cat # Commentaires Haute capacité de kit archive ADNc Tampon 10x ADNc archivage dNTP (100 mM) Virus de la leucémie murine de Moloney (MMLV) transcriptase inverse (50 U / pl) Applied Biosystems 4368814 modifiés protocole RNaseOUT (40 U / pl) Invitrogen 10777019 x-Plex mélange d'amorces reverse tige-boucle (40 nM) * Integrated DNA Technologies Personnalisé Séquences * DEPC eau traitée Volume de réaction: 5,5 ul Remarque: la concentration finale des amorces tige-boucle devrait être 1-5 nM (ici 2 nM). Préparer Master-Mix (volumes par réaction) comme suit: 1. DEPC eau 1,959 ul 2. 10x RT-Buffer 0,55 ul 3. Inhibiteur de RNase (40 U / pl) 0,0715 ul 4. dNTP (100 mM) 0,275 ul 5. x-Plex mélange d'amorces reverse tige-boucle (40 nM) * 0,275 ul 6. MMLV-RT (50 U / pl) 0,369 ul Mix et centrifuger brièvement. Ajouter 3,5 ul Master-Mix d'un échantillon de 2 pl. Procédez comme suit RT-réaction: 16 ° C pendant 30 minutes, suivie par 60 cycles à 20 ° C pendant 30 secondes, 42 ° C pendant 30 secondes, 50 ° C pendant 1 seconde et enfin 85 ° C pendant 5 minutes pour inactiver MMLV-RT, 4 ° C ∞ . Conserver à -20 ° C jusqu'à utilisation. * Liste des inverser tige-boucle amorces peuvent être trouvés au http://urology.ucsf.edu/blellochlab/protocols.htm 5. Pré-amplification (pré-PCR) (Suite à un protocole par Tang et al. 2 avec des modifications.) Nom du réactif Société Prod / Cat # Commentaires dNTP (100 mM) Applied Biosystems 4368814 Capsule haute. Kit archive ADNc. 2x Universal PCR Master Mix avec NoAmpErase UNG Applied Biosystems 4324018 x-Plex mélange d'amorces vers l'avant (450 nm) * Integrated DNA Technologies Personnalisé Séquences * Universal amorce inverse (100 uM) Integrated DNA Technologies Personnalisé Séquence 2 Polymérase AmpliTaqGold (5 U / pl) Applied Biosystems 4311806 MgCl 2 (100 mM) DEPC eau traitée Volume de réaction: 27.5μl (22μl MM + 5.5μl RT-produit) Remarque: pré-amplification est nécessaire pour améliorer la force du signal, en particulier lorsque la concentration de départ de l'ARN est limité. Le niveau d'entrée ARN détermine le nombre optimal de cycles de pré-PCR. Compte tenu de la même efficacité relative de chaque cycle de PCR devrait doubler la concentration du produit final. Comme certains miARN sera plus fortement exprimée, éviter la sur le cyclisme. Toutefois, la sous-amplification peut entraîner une perte de sensibilité de détection, notamment pour les microARN exprimé à des niveaux faibles. Dans nos mains 12 cycles d'amplification pré, en utilisant 100 ng d'ARN total, apparaissent suffisantes. En utilisant du sérum comme matériau de départ, 12 résultats des cycles de niveaux détectables miARN, mais 15 cycles semblait être supérieure. Enfin, à partir de 3 ovocytes (environ 400 pg d'ARN total par ovocyte 3), 16 pré-amplification des cycles succès nous a permis de dépister les niveaux d'expression de microARN 4. * Liste des amorces sens peut être trouvé au http://urology.ucsf.edu/blellochlab/protocols.htm Préparer Master-Mix (volumes par réaction) comme suit: 1. 2x universelle MM 13,75 ul 2. DEPC eau 0,792 ul 3. MgCl 2 (100 mM) 0,55 ul 4. dNTP (100 mM) 1,1 ul 5. x-Plex mélange d'amorces vers l'avant (450 nm) 3,06 ul 6. Universal RP (100 uM) 1,375 ul 7. Polymérase AmpliTaqGold (5 U / pl) 1,375 ul Mélanger et centrifuger brièvement. Ajouter 22 ul Master-Mix à chaque 5,5 ul RT-produit. Effectuez les opérations suivantes pré-PCR: 95 ° C pendant 10 min, 55 ° C pendant 2 min, suivie par 10 à 18 cycles de 95 ° C pendant 1 s et 65 ° C pendant 1 min, 4 ° C ∞. 6. La purification du produit pré-PCR Purification par sélection de la taille sur un gel de polyacrylamide natif de 10% Nom du réactif Société Prod / Cat # 40% d'acrylamide / Bis Solution Bio-Rad 161-0144 TEMED Bio-Rad 161-0801 10 bp échelle d'ADN Invitrogen 10821-015 SYBR Or gel d'acide nucléiques tache 10000 X concentrent dans le DMSO Invitrogen S11494 Le glycogène (20 mg / ml) Roche 10 901 393 001 Tampon-EB Ammoniumpersulfate 10% (APS) DIX-Buffer 6x Orange G DEPC eau traitée ddH2O a. Préparation de gel Pour faire 10ml d'un mélange de polyacrylamide à 10%, ajouter 1. ddH 2 O 6,5 ml 2. TBE 10x 1 ml 3. Polyacrylamide (40%) 2,5 ml 4. APS (10%) 80 ul 5. TEMED 4 pl Préparer échelle d'ADN: 0,5 ul 10 échelle d'ADN pb 4,5 pi de tampon (EB) 1 pl 6x Orange G Ajouter 5,5 ul 6x Orange G à chaque 27,5 ul pré-PCR produit. b. Exécuter Gel Exécuter Gel avec 150V pour 55-60 minutes. Remarque: le bleu de bromophénol comme indicateur fonctionne avec la région 20 pb. C. Gel Stain Tache de gel avec SYBR-Gold pour 25 minutes sur agitateur. Remarque: SYBR-Gold est sensible à la lumière. d. Couper Gel Découpez des bandes de produit pré-PCR de 60 à 80 pb et transfert à tube étiqueté. Remarque: Une bande de faible ARN d'entrée pré-PCR des produits pourraient ne pas être visibles. Crush bande de gel (tube de centrifugation par exemple dans le tube). e. Re-extrait d'ADNc Ajouter 300 ul RTE-tampon et incuber à 37 ° C pendant 4 heures sur un agitateur. Transfert de fluides d'un tube de collecte étiquetés, ajouter un autre 300 ul RTE-tampon dans le tube de gel contenant et incuber le tout à 4 ° C pendant la nuit sur un agitateur. Aspirer le liquide restant, le transfert sur le tube de collection désignée comme avant et noter le volume total récupéré. f. Précipitation à l'éthanol Ajouter 3 volumes d'éthanol à 100% la température ambiante. Ajouter 0,5 ul glycogène (20 mg / ml). Vortex. Incuber sur la glace sèche pendant au moins 2 heures ou à -80 ° C la nuit. De spin dans microcentrifugeuse à 4 ° C pendant 30 minutes pour obtenir un culot d'ADNc. Dump de liquide, ajouter 700 ul température ambiante 75% d'éthanol et de spin pendant 10 minutes. Dump de liquide et de spin à nouveau pendant 5 minutes. Sucer surnageant sans déranger granulés et sécher à l'air pendant 10 minutes. Reprendre le culot dans de l'eau propre. Remarque: le volume désiré de la solution concentrée d'ADNc est dépendante sur le design expérimental et devrait inclure des expériences de contrôle. 7. La purification du produit pré-PCR Purification par digestion enzymatique des amorces suivi par la colonne de spin (suivant les protocoles fabrique) Nom du réactif Société Prod / Cat # ExoSAP-IT USB-Affymetrix 78250 Kit MinElute PCR Purification Qiagen 28004 Remarque: Dans nos mains l'exclusivité enzymatique de nettoyage amorces supprimé avec succès, mais aussi conduit à une dégradation partielle du produit de pré-amplifiée, probablement en raison de dénaturation partielle des produits courte que la température monte jusqu'à 80 ° C pendant l'étape de l'inactivation du enzymatique. Eviter inactivation par la chaleur et directement purification des produits PCR de la réaction enzymatique utilisant colonnes de centrifugation élimine tout apprêt, sans dégradation du produit. Mélanger 5 ul post-PCR produit avec 2 ul ExoSAP-IT. Incuber à 37 ° C pendant 15 minutes à se dégrader amorces restantes et les nucléotides. Ajouter 5 volumes de tampon PB pour 1 volume de la réaction PCR et mélanger, si j'ai indicateur de pH a été ajouté au tampon PB, vérifiez que la couleur du mélange est jaune. Placer une colonne dans une condition MinElute tube collecteur de 2 ml dans un rack approprié. Appliquez l'échantillon à la colonne MinElute et centrifuger pendant 1 minute. Jeter l'éluat, placer la colonne MinElute revenir dans le même tube et ajouter 750 pi de tampon PE à la colonne MinElute à laver et centrifuger pendant 1 minute. Jeter l'éluat et le lieu de la colonne de retour MinElute dans le même tube. Centrifuger la colonne pour un supplément de 1 minute à vitesse maximale. Placer la colonne dans un endroit propre MinElute 1,5 ml microtube. Pour éluer l'ADN, ajouter 10 ul d'eau DEPC traitées au centre de la membrane, laissez la colonne reposer pendant 1 minute, puis CENcentrifugeuse pendant 1 minute. 8. Fludigim 96,96 qRT PCR profilage Nom du réactif Société Prod / Cat # Commentaires Fluidigm 96,96 Kit Dynamic Array 96,96 tableau dynamique 96,96 fluides ligne de contrôle Réactif 20x Chargement Fluidigm Corporation Mélange de Amorce reverse universelle (1 pM) Amorce sens (1 pM) Sonde TaqMan (0,2 M) Integrated DNA Technologies Personnalisé Séquence (1) 2x Universal PCR Master Mix avec NoAmpErase UNG Applied Biosystems 4324018 Tween 1. Amorçage de la SFI 96.96 Dynamic Array Injecter du liquide de ligne de commande (150 pl) dans chacun des accumulateurs sur la puce. Puce Placer dans la SFI (intégré fluidiques circuit) contrôleur et exécuter le premier (136x) script pour fluide de commande de ligne principale dans la puce. Remarque: Chip doit être utilisé 24 heures après l'ouverture du paquet. Assurez-vous de ne pas renverser le liquide ligne de contrôle puisque le liquide de ligne de commande sur la puce ou dans les criques rend la puce inutilisable. Chip doit être chargé dans les 60 minutes de l'amorçage. 2. Préparation des échantillons 2.1 Pré-Préparation d'échantillons Dans un tube en plastique jetables, mélanger les composants dans le tableau ci-dessous pour rendre l'échantillon-Pre-Mix (volumes par entrée). 2x TaqMan Universal Mix Master 2,5 pi Réactif 20x Chargement 0,25 ul Remarque: Le volume final est de 2,75 ul, comme des excédents pour la pipette se dispenser des pertes 2.2 préparation des échantillons Mélanger dans 96 puits de format de chaque échantillon avec un mélange de l'échantillon pré-(volumes par entrée). Pré-Sample-Mix 2,75 ul Exemple 2,25 ul Remarque: Vortex et centrifuger brièvement plaque de 96 puits pour recueillir du liquide. Volume final par entrée 5 pl, prendre en compte la perte de pipetage en préparant un volume légèrement plus élevé. 2.3 Préparation des dosages 13x Utiliser une plaque à 96 puits pour préparer des dosages 13x. 1x concentrations dans le tableau ci-dessous, l'échelle pour 13x. Universal Primer inverse 1 um (1x) Séquence à 2 * Amorce sens 1 um (1x) * Spécifiques du gène sonde TaqMan # 0,2 um # * Liste des amorces sens peut être trouvé au http://urology.ucsf.edu/blellochlab/protocols.htm Liste des sondes TaqMan # peut être trouvé au http://urology.ucsf.edu/blellochlab/protocols.htm Mélanger dans une plaque de 96 nouveaux aliquotes ainsi des essais avec du Tween 13x pour une concentration finale de 0,25% de Tween Remarque: Le volume final par l'entrée est de 5 pi, de préparer un volume suffisant (5,5 pi) de prendre la perte de volume pendant le transfert en compte. Mélangez bien, en évitant les bulles et centrifuger brièvement pour ramasser fluide. 3. Chargement de la puce Remarque: Afin de permettre le chargement correct des échantillons et les analyses assurer le positionnement correct de la puce. Il est commode d'aligner l'encoche dans le coin supérieur gauche. S'assurer que tous les test et les solutions d'échantillon sont mélangés avant le chargement de la puce. Il est commode de le faire dans une plaque à 96 puits et spin bas de la plaque avant de charger la puce. Soyez conscient de la carte puce de pipetage pour référence ultérieure. Entrées de l'échantillon non utilisés doivent être remplis avec 2,75 Mélanger l'échantillon d'eau et 2,25 ul ul ADN libre. Entrées de dosage non utilisés doivent être remplis avec 2,5 réactif de dosage de chargement et de 2,5 ul d'eau ul. Ne pas dépasser le premier arrêt lors du pipetage pour éviter d'introduire des bulles d'air. Après le chargement des échantillons et des essais (Volume par entrée: 5 pl) exécuter le script de chargement Mix (136x) script pour charger les échantillons et les analyses dans la puce. Après le script est terminé, retirez la puce du contrôleur ICF. Pelez la pellicule de protection bleue à partir du dessous de la puce chargée. Enlevez toutes les particules de poussière ou des débris de la surface de la puce. 4. 96,96 qRT-PCR Transfert de la puce au système BioMark et utiliser les conditions suivantes de l'amplification: 55 ° C pendant 2 min, 95 ° C pendant 10 min, suivie par 40 cycles de 95 ° C pendant 15 s et 55 ° C pendant 1 min. Suivre le protocole de fabrication pour la collecte de données du logiciel. 5. Utilisation du logiciel d'analyse qPCR Après la RT-PCR du logiciel propriétaire fournit des courbes d'amplification, des cartes de chaleur et les valeurs de Ct pour chaque puits. S'il vous plaît se référer au manuel du logiciel pour l'analyse des données. 9. Les résultats représentatifs: Figure 1. Représentation schématique du flux de production expérimentale. Montré est une description étape par étape du multiplex qRT-PCR, y compris la purification (étape e) d'amorces excessive de la transcription inverse multiplex (étape C) et préamplification multiplex (étape D) avant détection en temps réel (étape f), résultant en un modèle purifiée d'ADNc pour qRT-PCR. FP: microARN amorces spécifiques de l'avant, URP: amorce reverse universel, R-SLP: microARN spécifiques inverse tige-boucle primaire. Cliquez ici pour agrandir l'image. Figure 2. . Purification sur gel Polyacryamide du modèle qRT-PCR après pré-PCR bandes de la taille du produit pré-PCR sont exclusivement vu dans les échantillons de WT, mais pas dans microARN DGCR8 déficiente – / – ou Dicer – / – échantillons (flèches) après 96-plexe RT et 12 cycles de préamplification. Notez que des produits non spécifiques d'origine inconnue (flèches) et les amorces excessive se retrouvent dans tous les échantillons (étoiles). Figure 3. Purification après préamplification multiplexe améliore grandement la précision des qRT-PCR a) Comparaison des niveaux d'expression relative de WT MESC d'Dgcr8 -. / – (MicroARN canoniques déficient) MESC révèle 1) la détection de plus de microARN et 2) la perte de faux positifs signaux dans Dgcr8 – / – après purification horizons loin amorces du produit pré-PCR. b) Après purification, les niveaux d'expression relative des deux DGCR8 – / – / WT et Dicer – / – / WT montrent une perte de faux signaux positifs et permettent de catégorisation appropriée des rares Dgcr8 indépendante / dépendante Dicer petits ARN (miR-320, – 484, -877) 5. Figure 4. Fluidigm haut débit profilage miARN qRT-PCR. Exemple capture d'écran de 96,96 Fluidigm qRT PCR profilage mircoRNA à l'écran de modification des niveaux de miARN de sérums de la prostate malade du cancer. Le logiciel en temps réel qPCR analyse fournit des courbes d'amplification, des cartes thermiques de couleur et de cycle seuil (Ct).
