Tüm Dağı In situ Moleküler Biyoloji ve organizma Biyoloji Link Hibridizasyon

1. Plazmid cDNA Hedef Dönüşüm Bölüm I: Plazmid Dönüşüm (Gerekli Zaman: 3 saat artı bir gecede inkübasyon) 42 ° C su banyosunda sıcak SOC besin suyu (reaksiyon başına 500 mcL) Buz üzerinde yetkili hücreleri Çözülme 25 mcL yetkili hücrelere plazmid 1 mcL ekle 20 dakika boyunca buz üzerine yerleştirin. 45 saniye için 42 ° C su banyosu içinde ısı şok hücreleri Hemen 2 dakika boyunca buz üzerinde hücre 42 ° C besin suyu hücrelerin her flakon 500 mcL ekleyin 37 ° C'de 2 saat boyunca dakikada 255 rotasyonlar (rpm) çalkalayınız Plaka 75 Luria Bertani (LB) agar plaklarına mcL dönüşüm karışımı Inkübe plakaları 37 ters ° C gecede Bölüm II: E. coli Kültür (Zaman: 15 dakika artı bir gecede inkübasyon) Bir kültür tüp içine her reaksiyon, kısım 3 ml LB suyu ve 50 mg / ml ampisilin 3 mcL Agar plaka 1 bakteri kolonisi kazıyın ve her kültür tüpüne ekleyin 37 kültür tüpleri çalkalayın ° C 255 rpm gecede Bölüm III: Plazmid Hazırlık (Gerekli Zaman: 1.5 saat) 5 Başbakan FastPlasmid Mini Kit (Katalog # 2300000) kullanarak bir gecede kültürlerden gelen plazmid Isolate Hazırlanan plazmid varlığını kontrol etmek için, etidyum bromür ile boyanmış% 1 Tris-asetat-EDTA (TAE) ve jel kiti yıkandı, DNA çalıştırın 2 Situ DIG etiketli RNA Prob Sentezi Bölüm I: Plazmid lineerleştirilmesi (Gerekli Zaman: 2,5 saat) 1.5 mL mikrofuge'de tüp, bir araya getirir:. Plazmid Hazırlayan: 20 ml Restriksiyon enzimi * 2 mL Tampon ** 10 ml 10X Bovine Serum Albumin (BSA) 10 ml Dietil Pyrocarbonate (DEPC) Su 58 ml 100 mL 37 ° C'de 2 saat süreyle inkübe * Plazmid ile değişir ** Restriksiyon enzimi ile değişir. Bölüm II: Transkripsiyon (Gerekli Zaman: 3 saat) 1.5 mL mikrofuge'de tüp, bir araya getirir:. Plazmid Doğrusal 4 mL 10X Transkripsiyon Tampon ** 4 mL Digoxigenin Etiket Karışımı 4 mL Polimeraz * 2 mL RNaz İnhibitör 2 mL DEPC Su 24 ml 40 ml 1 saat için 37 ° C'de inkübe Polimeraz * 2 mcL ekle 1 saat için 37 ° C'de inkübe Ekle 2 DNaz mcL 37 ° C'de 20 dakika * Plazmid ile değişir ** Polimeraz ile değişir. Bölüm III: Yağış (Gerekli Zaman: gecede inkübasyon, 1 saat 5 dakika artı 2 saat santrifüj ve yeniden askıya alma) 0,2 M EDTA 4 mcL ekle 4M lityum klorür 5 mcL ekle Buz gibi% 100 etanol 150 mcL ekle Gecede için -80 ° C'de 2 saat süreyle inkübe 4 ° C, süzün uzakta supernatant 30 dakika 14.000 rpm'de Santrifüj 7 dakika Kuru pelet 20 mcL DEPC su yeniden askıya 37 ° C'de 5 dakika Bölüm IV: Fraksiyonu – prob boyutu 0,6 kb daha büyük ise gerçekleştirin (Gerekli Zaman: Genellikle hayır, 20 dakikadan fazla prob boyutuna göre değişir) 1.5 mL mikrofuge'de tüp, bir araya getirir:. RNA Probe 20 ml DEPC Su 12 mL Sodyum bikarbonat 4 mL Çamaşır sodası 4 mL 40 ml 60 ° C su banyosunda inkübe edin. Denklemi inkübasyon süresi Duy: Süresi (dak.) = (kb başlangıç ​​istenilen kb) / (0,11 x kb x itibaren istenilen kb) Ortalama istenen büyüklük = 0.6 kb Bölüm V: Final Yağış (Gerekli Zaman: 5 dak.gecede inkübasyon, 1 saat oda ısısında artı 2 saat) santrifüj ve jel elektroforezi için yeniden askıya alma, 1 saat 40 mcL DEPC su ekleyin 8 mcL Sodyum Asetat ekle 1.04 mcL Asetik Asit 240 mcL buz gibi% 100 etanol ekle Gecede için -80 ° C'de 2 saat süreyle inkübe 4 ° C, süzün uzakta supernatant 30 dakika 14.000 rpm'de Santrifüj 7 dakika Kuru pelet 20 mcL DEPC su yeniden askıya Karıştırmak için Vortex Spastine Özgü Riboprop varlığını kontrol için% 1 TAE jel boyanmış, etidyum bromür ile tekrar askıya çözüm çalıştırmak 3. Tüm Dağı Situ Hibridizasyon Bölüm I: Embriyolar fiksasyonu ve Proteinaz K Sindirim (Gerekli Zaman: Fix gecede artı 4 saat saklama için ertesi gün, 2,5 saat depolama Bölüm II) Zebra balığı embriyolar sahnelenen toplayın ve gece 4,% 4 paraformaldehid (PFA) düzeltmek ° C Tween-20 (PBSt) 3 kez 10 dakika her biri için% 0.1 içeren sabit embriyolar yıkayın fosfat tamponlu salin Ince uçlu forseps kullanarak deneysel reaktifler, elle dechorionate embriyolar (gerekirse) embriyoların pozlama sağlamak için Bir saat süreyle% 25 oranında kademeli bir dizi her yıkama, yıkama ve PBSt% 50 metanol dehydrate embriyolar, daha sonra -20 ° C'de% 100 metanol içinde saklamak Kullanıma hazır,% 50 (2 kez) ve% 25 (1 kez), her biri için 10 dakika PBSt metanol yıkama PBSt embriyoların rehidrate. Son olarak, her biri için 10 dakika% 100 PBSt 2 kez yıkayın. Kesin zamanlama PBSt / metanol yıkar için önemli değildir Koyu pigmentleri uzaklaştırmak için PBSt% 10 hidrojen peroksit çözeltisi gerekirse, Bleach embriyolar. Embriyolar, 10-20 dakika boyunca, embriyonun yaşına bağlı olarak hidrojen peroksit çözeltisi inkübe gerektiğini ve mikrofuge'de tüp kapağı hava basıncı birikmesini önlemek için açık kalmalıdır 50 mg / ml proteinaz K ile Digest embriyolar embriyo yaşına bağlı olarak 3-15 dakika PBSt 1:5000 sulandırılmış Re-fix 30 dakika boyunca% 4 PFA embriyolar ve her 5 dakika için, PBSt 3 kere yıkayın Bölüm II: Riboprobes Hibritleşme (Gerekli Zaman: 3 saat artı hibridizasyon için bir gecede, 1.5 saat Bölüm III ertesi gün) 2-3 saat önceden ısıtılmış 70 ° C su banyosunda prehybridization solüsyonu (PHS) embriyo Prehybridize PHS Kaldır 0.5 ml, 70 ° C gece boyunca inkübe hibridizasyon çözüm ve 1.5 mcL önceden sentezlenmiş digoxigenin etiketli riboprobes, ekleyin. Sıcaklık Spastine Özgü Riboprop hedef bağlı olarak birkaç derece içinde dalgalanma Ertesi gün, 70 embriyolar yıkayın ° C PHS her biri için 10 dakika tuzlu 2X-sodyum sitrat (SSC)% 75,% 50 ve% 25 oranında kademeli çözümler, sonra 68, 30 dakika boyunca 0,2 X SSC yıkayın ° C Her biri için 10 dakika oda sıcaklığında Maleik Asit Buffer (MAB) 2 kez yıkayın Bölüm III: Anti-digoxigenin (α-DIG) Antikor Kuluçka (Gerekli Zaman: 3 saat artı engellemek için bir gecede 2,5 saat Bölüm IV ertesi gün) 12 plaka embriyolar transfer Ön blok embriyolar en az 3 saat boyunca oda sıcaklığında 1-2 ml engelleme çözümü Aynı zamanda, bu çözüm engelleme çözümünün ikinci bir birim hazırlıyor ve anti-digoxigenin antikor 1:2000 seyreltilmesi antikor ön blok Blok öncesi çıkarın ve 1-2 ml önceden bloke α-DIG çözüm ekleyin, 4 gece boyunca inkübe ° C Ertesi gün, MAB embriyoların yıkayın. Embriyolarının ilk 5 dakika MAB inkübe izin ver, sonra tampon değişiklikleri gerçekleştirmek ve iki 10 dakika, bir 30 dakikalık ve bir 60 dakikalık zaman aralığı inkübe edin. Kesin zamanlama gerekli değildir Alkalen Fosfataz (AP) tampon her 5 dakika için embriyoların 3 kere yıkayın Bölüm IV: Boyama ve Final İşleme (Gerekli Zaman: 1 saat, geceleme boyama kullanılan Spastine Özgü Riboprop bağlı olarak, gliserol yıkar, gliserol yıkama başına 6-10 saat başına 4 saat gliserol saklanabilir) Boyama yeterli kadar, 1-2 ml boyama çözüm embriyoların plaka folyo ile sarın ve düzenli aralıklarla (her 20 dakika) boyama kontrol Boyanma reaksiyonu durdurmak için her biri için 5 dakika PBSt 2 kez embriyo yıkayın Arka plan boyama kaldırmak için,% 100 metanol sonra 10 dakika yıkar% 25 (1 kez) ve% 50 (2 kez) PBSt metanol kullanarak embriyolar dehydrate Embriyoların% 100 metanol içinde en az 2 saat oda sıcaklığında inkübe izin verin 50% 10 dakikalık yıkama (2 kez) ve% 25 (1 kez) PBSt metanol kullanarak PBSt rehidrate, sonra% 100 PBSt 2 kez yıkayın Lekeli e aktarma4 kademeli bir yıkama, bir dizi ve mağaza kullanarak PBSt% 80 gliserol çözüm mbryos ° C. Tarifler: LB agar plakları 10 g LB agar + 250 mL distile su, otoklav, dokunmatik serin her petri kaplarına dökün 15-20 mL sıcak çözüm, 250 mcL ampisilin, agar katılaşmaya izin LB besiyeri 12,5 g LB Broth + 200 mL distile su, otoklav, kullanmadan önce soğumasını bekleyin. % 1 TAE jel 0.4 g agaroz, 40 ml 1X TAE, 2 mcL etidyum bromür; yük 7 mcL plazmid (cDNA Hedef Plazmid Dönüşüm) veya 3 mcL Spastine Özgü Riboprop ve 4 mcL DEPC su (in situ DIG etiketli RNA Prob Sentezi) + 1 mcL yükleme boya, 5 mcL DNA merdiveni Prehybridization çözüm% 50 formamid, 5X SSC, 9.2mM sitrik asit,% 1 Tween-20 Hibridizasyon çözüm prehybridization çözümü artı 500 mg / ml tRNA ve 50 mikrogram / ml Heparin Maleik Asit MAB-100mm, 150mm NaCl, 0,2 M NaOH,% 0.1 Tween-20, 7.5 pH MAB Engelleme Çözüm-3 parça MAB, 1 kısım% 10 Boehringer engelleme reaktif, 1 parçası ısı kuzu serum devre dışı 9.5 AP tampon-60mm Tris-HCl pH, 60mm NaCl, 30mm MgCl 2,% 0.1 Tween-20 Boyama Çözüm-5-Bromo-4-kloro-3-indolyl fosfat (BCIP) ve Nitro mavi tetrazolium (NBT) AP tampon 4. TEMSİLCİSİ SONUÇLAR Doğru yapıldığında, NBT BCIP ve alkalen fosfataz arasındaki reaksiyon zebrafish embriyo mor bir leke olarak görünmelidir mor bir çökelti oluşacaktır. Riboprobes ilgi gen cDNA ilgili daha önce sentezlenmiş olmalıdır. Bu nedenle, herhangi bir leke görüntülenebilmekte, o belirli gelişimsel aşamada ilgi gen transkripsiyonu edildiği zebrafish alanlarda temsil söylenebilir. Fgf8a (Reifers vd, 1998; Şekil 2); deltaC (Oates ve ark, 2005) Bu dersin amacı, riboprobes aldh1a2 (Begemann ve ark, 2001; Şekil 1, daha önce raldh2) sentezlenmiştir; myod1 (Weinberg ve ark, 1996); shha (. Krauss ve ark, 1993), pax2a (Marka ve ark, 1996; Şekil 3) ve myl7 cDNA (önceden cmlc2; Yelon ve ark, 1999). Boyama, orta hatta ve Somitlerin tailbud, myotome, beyin ve kalp gibi anatomik yapıların bekleniyordu. Ace/fgf8a mutantlar bu yapıların pek çok kusurları olması beklenmektedir . Boyama kolayca standart bir diseksiyon mikroskobu kullanılarak görüntülendi. (Schoenwolf, 2009; D'Costa ve ark, 2009; Schmoldt ve ark, 2009. Clark, 2003) Ek kaynaklar burada açıklanan benzer teknikleri İSTEDİKLERİ hakkında daha fazla bilgi ve sorun giderme içerir. Şekil 1 aldh1a2 için özel riboprobes ile melezleşmiştir olmuştur zebrafish embriyo 24 saat gübreleme,. Özel boyama, göz, beyin, göğüs yüzgeci tomurcuk primordia ve Somitlerin görülebilir. Anterior, üst, arka alt etmektir. Şekil 2. 13 hücre gruplarının gelişme aşamasında zebrafish embriyo fgf8a için bir prob özel melezleşmiştir olmuştur. Özel boyama telencephalon, sırt diensefalon, orta beyin-Beyin sınır, Somitlerin ve tailbud görülür. Ventral sol, sağ dorsal. Şekil 3 pax2a, sinir sisteminin görüntülenmesi için yararlı güçlü bir belirteç için bir Spastine Özgü Riboprop özel melezleşmiştir 22 saat sonra döllenme zebrafish embriyo. Özel boyama koroid fissür, orta beyin Beyin sınır, otik vezikül ve spinal kord nöronları görülebilir. Dorsal anterior sol görünümü.