Mit Whole Berg In situ Hybridisierung zu Molecular Biology und Organismal Link-
Summary
Whole mount<em> In situ</em> Hybridisierung (WISH) wurde in einer oberen Ebene Bachelor Vergleichende Wirbeltiere Biology natürlich zusätzlich zu Dissektionen Wirbeltiere eingesetzt. Dies gab den Studierenden die Möglichkeit zu Genexpressionsmuster sowie grobe Anatomie zu studieren und verbindet das Studium der molekularen und organismischen Biologie in einem Kurs.
Abstract
Whole mount in situ Hybridisierung (WISH) ist eine verbreitete Technik in molekularbiologischen Laboratorien verwendet werden, um die Genexpression durch die Lokalisierung von spezifischen mRNA-Transkripte innerhalb der gesamten Probe aufsetzen zu studieren. Diese Technik (in Anlehnung an Albertson und Yelick, 2005) wurde in einer oberen Ebene Bachelor Vergleichende Wirbeltiere Biology Laboratory Klassenzimmer an der Syracuse University verwendet. Die ersten zwei Drittel des Comparative Biology Vertebrate Praktikum gab Studenten die Möglichkeit, der Embryologie und der makroskopischen Anatomie von mehreren Organismen, die verschiedene chordate Taxa in erster Linie über traditionelle Sezieren und die Verwendung von Modellen zu studieren. Der letzte Teil des Kurses beteiligt einen innovativen Ansatz zur Lehre Anatomie durch Beobachtung der Entwicklung von Wirbeltieren beschäftigt molekulare Techniken, bei denen Wunsch auf Zebrafisch-Embryos durchgeführt wurde. Eine heterozygote Fibroblasten-Wachstumsfaktor 8 a (fgf8a) Mutantenlinie, ace, verwendet wurde. Aufgrund Mendelschen Vererbung, Kreuzungen ace produziert Wildtyp, heterozygot und homozygot ace/fgf8a Mutanten in einer 1:2:1-Verhältnis. RNA-Sonden mit bekannten Expressionsmuster in der Mittellinie und in der Entwicklung anatomischen Strukturen wie Herz, Somiten, tailbud, Myotom und Gehirn verwendet. WISH wurde mit Zebrafisch auf den 13 Somiten und prim-6 Stufen, mit Studenten der Durchführung der Farbreaktion in der Klasse. Die Studie des Zebrafisch-Embryos in verschiedenen Stadien der Entwicklung gab den Studierenden die Fähigkeit zu beobachten, wie diese anatomischen Strukturen über Ontogenese verändert. Darüber hinaus zeigten einige ace/fgf8a Mutanten unsachgemäße Herzen Looping und Mängel in Somiten und die Entwicklung des Gehirns. Die Schülerinnen und Schüler in diesem Labor beobachtet die normale Entwicklung der verschiedenen Organsysteme mit beiden äußeren Anatomie sowie Genexpressionsmuster. Darüber hinaus identifiziert und Embryonen Anzeige falsche anatomische Entwicklung und Genexpression (dh, putative Mutanten) beschrieben.
Für Lehrer an Institutionen, die nicht bereits über die erforderlichen Geräte oder wo die Mittel für Labor-und curriculare Innovation beschränkt sind, können die finanziellen Kosten für die Reagenzien und Geräte ein Faktor zu betrachten, da wird die Zeit und Mühe auf den Teil der benötigten Lehrer unabhängig von der Einstellung. Trotzdem behaupten wir, dass die Verwendung von WISH in dieser Art von Unterricht im Labor Einstellung kann ein wichtiges Bindeglied zwischen Entwicklungsgenetik und Anatomie bieten. Die Entwicklung schreitet voran und die Fähigkeit zur organismischen Entwicklung auf molekularer Ebene Studie wird einfacher, billiger und immer beliebter, viele Evolutionsbiologen, Ökologen und Physiologen Forschungsstrategien im Bereich der Molekularbiologie drehen. Mit WISH in eine vergleichende Wirbeltiere Biology Laboratory Klassenzimmer ist ein Beispiel dafür, wie Moleküle und Anatomie kann in einem einzigen Kurs zusammen. Dies gibt oberen Ebene College-Studenten die Möglichkeit, moderne biologische Forschung Techniken, was zu einer stärker diversifizierten Bildung und die Förderung der Zukunft interdisziplinäre wissenschaftliche Forschung der Praxis.
Protocol
Discussion
Wunsch wurde in einer vergleichenden Wirbeltiere Biology Laboratory natürlich verwendet werden, um die Schüler verstehen die Rolle der Genetik in der anatomischen Entwicklung durch die Visualisierung von bekannten Genexpressionsmuster. Für den ersten Teil des Kurses, durchgeführt Studenten Sezieren von Organismen aus verschiedenen chordate Taxa, so dass sie genügend Zeit, um zu studieren, zu verstehen, Vergleichen und Gegenüberstellen Wirbeltiere Anatomie.
Als Einführung in den zweiten Teil des Kurses wurden die Schüler eine formelle Vortrag beschreibt Zebrabärblingentwicklung und Anatomie gegeben. Die Methoden und die erwarteten Ergebnisse des Wunsches Experiment wurden ebenfalls diskutiert. Die Schüler wurden dann leben Zebrafisch auf Somitogenese und prim-6 Stufen der Entwicklung gegeben, und bei 2 und 5 Tage nach der Befruchtung (dpf) unter dem Binokular untersucht. Das war es, den Studierenden ein besseres Verständnis von dem, was Zebrafischembryonen aussehen und welche Arten von morphologischen Veränderungen, die über Ontogenese auftreten.
In den nächsten Labor Sitzung wurden die SchülerInnen Zebrafischembryonen in die WISH zuvor hatte ausgeführt gegeben. Sie wurden gebeten, zu studieren und beschreiben die Genexpressionsmuster für jedes Gen von Interesse (Ribosonde verwendet). Embryonen für WISH wurden aus Paarungen zwischen den Mitgliedern einer heterozygoten ace/fgf8a Linie abgeleitet. Basierend auf Mendelschen Vererbung, waren 25% der Embryonen aus der ace/fgf8a Paarungen erwartet, um homozygote Mutanten zu sein und Mängel in vielen der anatomischen Strukturen auf die in diesem Kurs konzentriert aufweisen. Basierend auf den veröffentlichten Berichten und unveröffentlichte Beobachtungen in der Albertson Labor wurden Defekte im Gehirn und unsachgemäße Herzen looping erwartet, aber auch Mängel in den Somiten (Brand et al, 1996;. Albertson und Yelick, 2005; persönliche Beobachtungen).
Die Schüler wurden gebeten, alle Proben, Wildtyp (heterozygote Tiere sind nicht von Wildtyp-Geschwister in frühen Stadien der Entwicklung) und homozygote Mutanten zu untersuchen, für jeden Genexpressionsmuster vorgestellt. Sie wurden dann gebeten, Laborberichte beschreiben ihre Ergebnisse zu schreiben, und auf der Grundlage ihrer Kenntnisse der Anatomie und Genetik, wie defekte Gen-Expression kann anatomische Fehlbildungen gefällt haben.
Die Schüler schienen diese Laborübung mit Spannung und Neugier zu erhalten. Die meisten hatten noch nie verwendet WISH vor und waren sehr in diesem Teil des Kurses interessiert. Die Schüler fanden die unterschiedlichen Muster der Genexpression in der Zebrafisch-Embryos faszinierend, visualisiert einige sogar beschrieb die Färbungsmuster indem man sie mit bekannten Designs und Symbole, wie ein Smiley-Gesicht. Die daraus resultierende Laborberichte zeigten die Schüler hatten ein allgemeines Verständnis für den Wunsch-Protokoll und die Expression von Genen in bestimmten anatomischen Strukturen. Die Studierenden wurden auch erforderlich, um die spezifischen Funktionen der Gene zu verstehen studierte mit WISH während des Labor (Stickney et al, 2000;. Huelsken et al, 2002;. Geetha-Loganathan et al, 2008a;.. Geetha-Loganathan et al, 2008b ). Es war offensichtlich, aber dass bestimmte Teilnehmer beschränkt Hintergrundwissen über die Signalwege und Gene von Interesse war. Weitere Informationen zu diesen Konzepten in dem Wunsch Einführungsvortrag kann eine willkommene Ergänzung für die Verwendung von WISH in Zukunft Comparative Biology Vertebrate Kurse.
Da das Protokoll dauert in der Regel vier aufeinander folgenden Tagen, je nach dem Zeitplan des Kurses können die Schüler nur in der Lage sein, einen Teil des Experiments in der Klasse und der Lehrer muss für den Rest abgeschlossen. In unserem Comparative Biology Wirbeltiere Klasse abgeschlossen Studenten die Färbung Reaktionen im Labor, während die Teaching Assistant durchgeführt alle vorangegangenen Schritte. Wenn es bevorzugt ist, den Schülern durchführen wollen in der Klasse haben, kann das Protokoll in Untereinheiten, die über mehrere Sitzungen Labor durchgeführt werden, können je nach den zeitlichen Rahmen für die Klasse geteilt werden. Wenn es nicht machbar ist für Studenten das gesamte Protokoll durchführen, um, wie es hier war aufgrund der Labor-Sitzung nur einmal in der Woche können die Schüler die Färbelösung zu Beginn der Klasse hinzu, und, je nach Ribosonde verwendet werden, haben die Färbung komplett innerhalb einer Stunde. Die Zeit, die für den Fleck zu entwickeln variiert stark mit jedem Ribosonde und eine Vielzahl von experimentellen Bedingungen und sollten vor der Klasse vorgegeben werden. Bemerkenswert ist, wenn die Schüler nur dann entwickeln Sie den Fleck in Labor, wird Trainer ist verantwortlich für alle vorhergehenden Schritte, die viel Zeit und Aufwand außerhalb des Klassenzimmers erfordert. Falls gewünscht, könnte eine kürzere Alternative zu wünschen Immunhistochemie mit Antikörper Etiketten Proteinlokalisierung visualisieren, aber in dieser Zeit, sind Zebrafisch-spezifische Antikörper für Entwicklungsbiologie Gene nicht ohne weiteres verfügbar. Eine weitere Möglichkeit wäre, WISH auf verschiedenen Wirbeltierarten durchführennd haben die Schüler vergleichen die Expressionsmuster der gleichen Gene in verschiedenen Organismen (Pizard et al, 2004;. Aramaki et al, 2007;. Schwellenländer Modellorganismen, 2008; Schwellenländer Modellorganismen, 2010).
Das übergeordnete Ziel der Verwendung von WISH in eine vergleichende Wirbeltiere Biology Kurses war es, die Studierenden, wie molekularbiologische Techniken verwendet, um anatomische Entwicklung Studie zu demonstrieren. Es bot auch Gelegenheit für Studenten, wie veränderte Genexpression kann nicht nur zu Missbildungen, sondern auch auf evolutionären Wandel führen zu spekulieren. Formalisiert als evolutionäre Entwicklungsbiologie (oft als "Evo-Devo" genannt), soll mit diesem schnell wachsenden Bereich der Studie zur Genotyp und Phänotyp durch die Entwicklung zu verknüpfen und potenzielle mechanistischen Grundlagen der evolutionären Wandel zu erläutern. Mit dem Aufstieg der auf diesem Gebiet sind mehr Ökologen, organismal Biologen und Physiologen Einsatz molekularbiologischer Techniken in ihre Forschung. Wir behaupten, dass die Verwendung von WISH in eine vergleichende Wirbeltiere Biology natürlich wird dazu beitragen, den Lehrplan halten, um mit der derzeitigen technologischen und konzeptionellen Fortschritte in der Forschung bisher und eine bessere horizontale Ausrichtung der oberen Ebene der Biologie Kurse durch die Kombination von biologischen Teilfelder zu erleichtern. Darüber hinaus wird diese integrative Ansatz bieten den Studierenden die Möglichkeit, eine Auswahl an biologischen Forschung Techniken in einem Kurs lernen, was zu einer stärker diversifizierten Bildung und die Förderung der Zukunft interdisziplinäre wissenschaftliche Forschung.
Disclosures
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
Die Autoren möchten an das Department of Biology an der Syracuse University und Dr. Marilyn Kerr anerkennen für ihre Rollen in der Verwaltung des Comparative Biology Wirbeltiere natürlich. Die Albertson Labor ist durch Zuschüsse R21DE019223 von den National Institutes of Health / National Institute of Dental und kraniofaziale Forschung sowie zu gewähren R01AG031922 von den National Institutes of Health / National Institute on Aging unterstützt.
Materials
| Material Name | Type | Company | Catalogue Number | Comment |
|---|---|---|---|---|
| 5 Prime Fast Plasmid Mini Kit (100 preps) | Fisher | 2300000 | ||
| One Shot TOP10 Chemically Competent E. coli with SOC Medium | Invitrogen | C404003 | ||
| LB Agar | Fisher | BP1425-500 | ||
| LB Broth | Fisher | BP1426-500 | ||
| Ampicillin Sodium Salt | Fisher | BP1760-5 | ||
| Isopropanol | Acros | 42383-0010 | ||
| Petri Dish 100 x 20 mm non treated | Laboratory Products Sales | 430591 | ||
| 14 ml Culture Tube, Snap Top | Fisher | 1495911B | ||
| Restriction Enzymes & Buffers & 10xBSA | New England Bio Labs | varies | ||
| Diethyl Pyrocarbonate (DEPC) 25 ml | Sigma | D5758-25mL | ||
| Sodium Acetate Trihydrate USP/FCC 500g | Fisher | s608500 | ||
| Gal 200 proof Ethyl alcohol | Fisher | 04-355-451 | ||
| Tris-Acetate-EDTA (TAE) 50x Sol 1L | Fisher | bp13321 | ||
| Agarose Low EEO 100 g | Fisher | BP160-100 | ||
| Ethidium Bromide 10 ml | Sigma | 45-E1510 | ||
| Sucrose Gel Loading Dye 40% Sucrose | Fisher | BP655-1 | ||
| 1 kb Full Scale DNA Ladder | Fisher | BP2582200 | ||
| DIG RNA Labeling Mix | Roche | 11277073910 | ||
| T3 RNA Polymerase | Roche | 1031163 | ||
| T7 RNA Polymerase | Roche | 10881767001 | ||
| SP6 RNA Polymerase | Roche | 810274 | ||
| Protector Rnase Inhibitor | Roche | 3335399001 | ||
| Dnase I, Rnase Free 10,000 units | Roche | 4716728001 | ||
| EDTA molecular biology reagent | Sigma | e5134-500G | ||
| Lithium Chloride 100 g | Fisher | L121100 | ||
| Sodium Carbonate 1 kg | Fisher | BP357-1 | ||
| Sodium Bicarbonate, 500 g | Fisher | BP328-500 | ||
| Acetic Acid glacial ACS 500 ml | Fisher | a38500 | ||
| Paraformaldehyde R 500 g | Fisher | o4042500 | ||
| PBS Phosphate Buffer Saline 10X | Fisher | bp3991 | ||
| Tween 20 500 ml | Fisher | bp337500 | ||
| Methanol 5 L | Fisher | A4124 | ||
| Proteinase K 50 mg | Fisher | bp170050 | ||
| Formamide 1 L | Fisher | F841 | ||
| 20x SSC 1 L | Fisher | bp13251 | ||
| Citric Acid Anhydrous ACS 500 g | Fisher | a940500 | ||
| Ribonucleic acid transfer type V | Sigma | r7876-2.5KU | ||
| Heparin Sodium salt 50 mg | Fisher | bp252450 | ||
| Maleic acid R 500 g | Fisher | o3417500 | ||
| Sodium Chloride 500 g | Fisher | s271500 | ||
| Sodium Hydroxide 500 g | Fisher | s318500 | ||
| Blocking Reagent | Roche | 11096176001 | ||
| Lamb Serum 500 ml | Invitrogen | 16070096 | ||
| Anti DIG AP fragments | Roche | 11093274910 | ||
| 2M Tris Solution 500 ml | Fisher | bp1759500 | ||
| Magnesium Chloride 500 g | Fisher | m33500 | ||
| BCIP 3 ml | Roche | 11383221001 | ||
| NBT 3 ml | Roche | 11383213001 | ||
| Glycerol 99% 2.5 L | Fisher | AC158920025 | ||
| Plate 12 well PS ST w/Lid | VWR | 62406-165 | ||
| Tube 15 ml screw cap 50/rack 500/cs | Laboratory Products Sales | L262861 | ||
| Tube 50 ml screw cap 25/rack 500/cs | Laboratory Products Sales | L262890 | ||
| 1.6 ml microfuge tube | Laboratory Products Sales | L234401 | ||
| 2 Parafilm 2″ x 250 ft | Fisher | s37441 | ||
| Transfer Pipet 7 ml | USA Scientific | 1020-2520 | ||
| .1-10 μl Pipet Tip, Bulk | USA Scientific | 1111-3000 | ||
| 1-200 μl Pipet Tip, Bulk | USA Scientific | 1111-0006 | ||
| 101-1000 μl Pipet Tip, Bulk | USA Scientific | 1111-2021 | ||
| Aluminum Foil | Grocery Store |
- Autoclave
- Micro-centrifuge
- 37°C incubator (with shaker)
- 4°C micro-centrifuge
- Water bath
- Vortex
- Gel electrophoresis apparatus
- -20°C freezer
- -80°C freezer
- Rocker/shaker
- 4°C refrigerator
- Dissecting microscope (preferably with a teaching screen or camera)
References
- Albertson, R. C., Yelick, P. C. Roles for fgf8 signaling in left-right patterning of the visceral organs and craniofacial skeleton. Dev. Biol. 283, 310-321 (2005).
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