Todo el montaje utilizando In situ La hibridación de Enlace de Organismos y Biología Molecular

1. Transformación del plásmido de cDNA de destino Parte I: Transformación del plásmido (Tiempo requerido: 3 horas más de incubación durante la noche) Caliente el caldo SOC de nutrientes en un baño de agua 42 ° C (500 l por reacción) Descongelar las células competentes en hielo Añadir 1 l de plásmido a 25 células competentes l Coloque sobre hielo durante 20 minutos Las células de choque térmico de 42 ° C baño de agua durante 45 segundos Coloque inmediatamente las células en hielo durante 2 minutos Añadir 500 l de 42 ° C de caldo de nutrientes a cada vial de células Agite a 37 ° C durante 2 horas a 255 revoluciones por minuto (rpm) Placa 75 l de mezcla de transformación en placas de agar Luria Bertani (LB) Incubar las placas invertidas a 37 ° C durante la noche Parte II: E. coli Cultura (Tiempo requerido: 15 minutos más una noche de incubación) Para cada reacción, alícuota de 3 ml de caldo LB y 3 l de 50 mg / ml de ampicilina en un tubo de cultivo Raspar una colonia de bacterias de la placa de agar y añadir a cada tubo de cultivo Agitar los tubos de cultivo a 37 ° C a 255 rpm durante la noche Parte III: Preparación plásmido (Tiempo requerido: 1,5 horas) Aislar el plásmido de cultivos de una noche con el primer Mini Kit de 5 FastPlasmid (Catálogo # 2300000) Para comprobar la presencia de plásmidos preparados, ejecute el ADN eluido del kit en un gel de 1% Tris-acetato-EDTA (TAE) teñido con bromuro de etidio 2. In Situ marcada con DIG síntesis de ARN sonda Parte I: Linealización del plásmido (Tiempo requerido: 2.5 horas) En un tubo de microcentrífuga de 1,5 ml, se combinan: Preparado plásmido 20 ml * Restricción de enzimas 2 mL Buffer ** 10 ml 10 veces más albúmina de suero bovino (BSA) 10 ml Dietil pirocarbonato (DEPC) de agua 58 ml 100 ml Se incuba a 37 ° C durante 2 horas * Varía con el plásmido ** Varía con la enzima de restricción Parte II: Transcripción (Tiempo requerido: 3 horas) En un tubo de microcentrífuga de 1,5 ml, se combinan: Lineal plásmido 4 ml Buffer 10X ** Transcripción 4 ml Digoxigenina Mix Etiqueta 4 ml Polimerasa 2 mL Inhibidor de la RNasa 2 mL DEPC agua 24 ml 40 ml Se incuba a 37 ° C durante 1 hora Añadir 2 l * de la polimerasa Se incuba a 37 ° C durante 1 hora Añadir 2 l de DNasa Se incuba a 37 ° C durante 20 minutos * Varía con el plásmido ** Varía con la polimerasa Parte III: Precipitación (Tiempo requerido: 5 minutos más 2 horas de incubación durante la noche, una hora para centrifugar y resuspender) Agregar 4 l de 0,2 M EDTA Añadir 5 l de cloruro de litio 4M Añadir 150 ml de hielo frío etanol al 100% Se incuba a 80 ° C durante 2 horas a la noche a la mañana Centrifugar a 14.000 rpm durante 30 minutos a 4 ° C, se decanta el sobrenadante de distancia Seco en pelets durante 7 minutos Vuelva a suspender en 20 l de agua DEPC Se incuba a 37 ° C durante 5 minutos Parte IV: Fraccionamiento – Realizar sólo si el tamaño de la sonda es mayor de 0,6 kb (Tiempo requerido: Varía según el tamaño de la sonda, por lo general no más de 20 minutos) En un tubo de microcentrífuga de 1,5 ml, se combinan: Sonda de ARN 20 ml DEPC agua 12 ml Bicarbonato de Sodio 4 ml Carbonato de Sodio 4 ml 40 ml Incubar en un baño de agua a 60 º C. La base del tiempo de incubación en la ecuación: Tiempo (min) = (a partir kb – deseado kb) / (0.11 x kb x partida deseado kb) Tamaño medio deseado = 0,6 kb Parte V: La precipitación final (Tiempo requerido: 5 minnutos más de 2 horas de incubación durante la noche, una hora para centrifugar y resuspender, 1 hora por electroforesis en gel) Añadir 40 l de agua DEPC Añadir 8 Acetato de Sodio l Añadir 1,04 l de ácido acético glacial Añadir 240 l de hielo frío etanol al 100% Se incuba a 80 ° C durante 2 horas a la noche a la mañana Centrifugar a 14.000 rpm durante 30 minutos a 4 ° C, se decanta el sobrenadante de distancia Seco en pelets durante 7 minutos Vuelva a suspender en 20 l de agua DEPC Vortex para mezclar Para comprobar la presencia de riboprobe, ejecutar la solución re-suspendido en un gel teñido 1% TAE con bromuro de etidio 3. Todo el montaje hibridación in situ Parte I: La fijación de embriones y la digestión de proteinasa K (Tiempo requerido: Fijar horas de la noche, más 4 al día siguiente para el almacenamiento, 2,5 horas de almacenamiento a la Parte II) Recoger etapas embriones de pez cebra y fijar en 4% paraformaldehido (PFA) durante la noche a 4 ° C Lavado de embriones fija en tampón fosfato salino que contiene 0,1% de Tween-20 (PBST) tres veces durante 10 minutos cada uno Para garantizar que la exposición de los embriones a los reactivos experimentales, los embriones de forma manual dechorionate (si es necesario) con unas pinzas de punta fina Deshidratar embriones por lavado en una serie gradual de 25% y 50% de metanol en PBST durante una hora cada lavado, a continuación, almacenar en el 100% de metanol a -20 ° C Cuando esté listo para usar, rehidratar embriones en PBST por el lavado en un 50% (2 veces) y el 25% (1 vez) de metanol en PBST durante 10 minutos cada uno. Finalmente lavar dos veces durante 10 minutos cada uno en el 100% PBST. Fecha exacta no es importante para los lavados con PBST / metanol Embriones cloro en una solución de peróxido de hidrógeno al 10% en PBST, si es necesario, para eliminar los pigmentos oscuros. Embriones se incuban en una solución de peróxido de hidrógeno durante 10-20 minutos, dependiendo de la edad del embrión, y la tapa del tubo de microcentrífuga deben permanecer abiertas para evitar la acumulación de presión de aire Embriones digerir con 50 mg / ml de proteinasa K diluido 1:5000 en PBST durante 3-15 minutos, dependiendo de la edad del embrión Fijar de nuevo los embriones en el 4% PFA durante 30 minutos y luego lavar 3 veces en PBST durante 5 minutos cada uno Parte II: La hibridación de ribosondas (Tiempo requerido: 3 horas y durante la noche para la hibridación, 1,5 horas del día siguiente a la Parte III) Prehybridize embriones con solución de prehibridación (PHS) en un horno precalentado a 70 ° C baño de agua durante 2-3 horas Quitar PHS, se añaden 0,5 ml solución de hibridación y 1,5 l previamente sintetizadas riboprobes digoxigenina etiquetados, se incuba a 70 ° C durante la noche. La temperatura puede variar dentro de unos pocos grados en función del objetivo riboprobe Al día siguiente, lave los embriones a 70 ° C en soluciones graduales de 75%, 50% y el 25% de PHS de citrato de sodio 2 veces con solución salina (SSC) de 10 minutos cada uno, luego se lava en 0,2 X SSC durante 30 minutos a 68 ° C Lave en tampón de ácido maleico (MAB) 2 veces durante 10 minutos cada una a temperatura ambiente Parte III: anti-digoxigenina (α-DIG) incubación del anticuerpo (Tiempo requerido: 3 horas y durante la noche para bloquear, 2,5 horas del día siguiente a la Parte IV) La transferencia de embriones en una placa de 12 pocillos Bloque de pre-embriones en una solución de 2.1 ml de bloqueo por lo menos 3 horas a temperatura ambiente Al mismo tiempo, antes de bloquear los anticuerpos mediante la preparación de un segundo volumen de la solución de bloqueo y la dilución 1:2000 del anticuerpo anti-digoxigenina en esta solución Eliminar pre-y agrega 1-2 ml pre-bloqueado α-DIG solución, incubar durante la noche a 4 ° C Al día siguiente, lave los embriones en el MAB. Permitir que los embriones se incuban en el MAB durante 5 minutos, luego realizar los cambios de tampón y se incuba durante dos de 10 minutos, un minuto 30 y un intervalo de 60 minutos. Fecha exacta no es necesario Lavado de embriones 3 veces durante 5 minutos en cada una de fosfatasa alcalina (AP) tampón Parte IV: La tinción y el procesamiento final (Tiempo requerido: 1 hora o toda la noche para la tinción, dependiendo de la riboprobe utilizados, 4 horas a partir de lavados de glicerol, 06.10 horas por lavado de glicerol, puede ser almacenado en glicerol) Agregar 1.2 ml de solución colorante a los embriones, envolver en papel de la placa y comprobar manchas a intervalos regulares (cada 20 minutos) hasta que la tinción es suficiente Lavado de embriones con PBST dos veces durante 5 minutos cada uno para detener la reacción de tinción Deshidratar embriones con 10 minutos se lava en el 25% (1 vez) y el 50% (2 veces) de metanol en PBST, luego en el 100% de metanol, para eliminar manchas de fondo Permita que los embriones se incuban en metanol al 100% por lo menos 2 horas a temperatura ambiente Rehidratar en PBST con 10 minutos se lava en el 50% (2 veces) y el 25% (1 vez) de metanol en PBST, luego lave en el 100% PBST 2 veces Transferencia e manchadombryos a una solución de glicerol al 80% en PBST, utilizando una serie gradual de lava, y se almacenan a 4 ° C. Recetas: Placas de agar LB-10 g de agar LB + 250 ml de agua destilada, autoclave, cuando están frías al tacto añadir 250 l de ampicilina, vierta solución caliente 15-20 ml en cada placa de Petri, permiten agar para solidificar Caldo de LB-12.5 g de caldo de LB + 200 ml de agua destilada, autoclave, deje que se enfríe antes de su uso 1% TAE gel de agarosa 0,4 g, 40 ml de 1X TAE, 2 l de bromuro de etidio; carga de 7 l plásmido (plásmido de transformación de la meta de ADNc) o 3 y 4 riboprobe l l de agua DEPC (In situ Síntesis marcada con DIG sonda de ARN) + un colorante de carga l, 5 l escalera del ADN Prehibridación solución-formamida al 50%, 5X SSC, 9,2 mm ácido cítrico, el 1% de Tween-20 Hibridación solución de prehibridación solución más 500 mg / ml tRNA y 50 ug / ml de heparina MAB-100mm ácido maleico, 150 mM NaCl, 0,2 M NaOH, 0,1% Tween-20, el pH a 7.5 Solución de bloqueo-3 partes del MAB, una parte del 10% reactivo Boehringer bloqueo en el MAB, un calor parte desactivado cordero suero AP-buffer 60 mM Tris-HCl pH 9,5, 60 mM NaCl, 30 mM MgCl 2, 0,1% Tween-20 Solución-5-Bromo-4-cloro-3-indolil tinción fosfato (BCIP) y nitro azul tetrazolio (NBT) en tampón AP 4. Los resultados representativos Cuando se realiza correctamente, la reacción entre el NBT, BCIP y fosfatasa alcalina se forma un precipitado violeta que deben aparecer en el embrión del pez cebra como una mancha púrpura. Riboprobes debe ser previamente sintetizada a partir de cDNA correspondiente al gen de interés. Por lo tanto, se puede concluir cualquier mancha visualizada representa las áreas del pez cebra en el que ha sido el gen de interés transcribir en esta etapa de desarrollo en particular. A los efectos de este curso, riboprobes se sintetizaron a partir aldh1a2 (antes RALDH2; Begemann et al, 2001;. Figura 1); fgf8a (Reifers et al, 1998;. Figura 2); deltaC (Oates y otros, 2005.) MyoD1 (Weinberg et al, 1996.) shha (. Krauss et al, 1993), pax2a (Brand et al, 1996;. Figura 3) y myl7 (antes cmlc2;. Yelon et al, 1999) cDNA. La tinción se espera en la línea media y en las estructuras anatómicas como las somitas, tailbud, miotoma, el cerebro y el corazón. Mutantes Ace/fgf8a se espera que tengan defectos de muchas de estas estructuras. La tinción se visualiza fácilmente usando un microscopio de disección estándar. Fuentes adicionales contienen más información y resolución de problemas en el deseo de técnicas similares a las descritas aquí (Clark, 2003;. D'Costa et al, 2009; Schmoldt et al, 2009;. Schoenwolf, 2009). Figura 1. Un embrión de pez cebra 24 horas después de la fecundación, que se ha hibridado con riboprobes específicas para aldh1a2. Tinción específica se puede ver en los ojos, la parte posterior del cerebro, aleta pectoral brote primordios, y somitas. Anterior es la parte superior, posterior está en el fondo. Figura 2. Un embrión de pez cebra en la etapa 13 somite de desarrollo que se ha hibridado con una sonda específica para fgf8a. Tinción específica se ve en el telencéfalo, diencéfalo dorsal, la cobertura del cerebro medio-hindbrain, somitas, y tailbud. Ventral está a la izquierda, dorsal está a la derecha. Figura 3. A 22 horas después de la fecundación de embriones de pez cebra que se ha hibridado con una específica para riboprobe pax2a, un marcador robusto útil para visualizar el sistema nervioso. Tinción específica se puede ver en la cisura coroidea, la cobertura del cerebro medio-hindbrain, vesícula ótica, y las neuronas de médula espinal. Vista dorsal con el anterior a la izquierda.