RNA de interferência em Carrapatos

1. Geração de dsRNA. Sintetizar primers contendo seqüências de promotor T7 para transcrição in vitro ea síntese de dsRNA (por exemplo, para Dermacentor variabilis subolesin usar primers D8AAT75: 5'-TAATACGACTCACTATAGGGTACTGACTGGGATCCCCTGCACAGT-3 'e D8DVT73: 5'-TAATACGACTCACTATAGGGTACTCGAGCTTGGTGGAAAGGACG-3'). Amplificar gene-alvo por RT-PCR utilizando 10 pmol de cada primer oligonucleotídeo e ng 1-10 de RNA total de carrapatos. Purificar o produto da PCR. Sintetizar dsRNA com 8 mL do produto da PCR purificada. Quantificar dsRNA por espectrometria. 2. Injeção de Carrapatos com dsRNA. 2.1. Preparação de carrapatos injectável. Primeiro, lave a carrapatos em uma série de soluções, agitando-os em cada solução em um tubo de centrífuga de 50 mL descartáveis, decantação a solução através de uma tela fina malha de arame sobre a parte superior do tubo para manter os carrapatos. A seqüência das soluções para os carrapatos de lavagem é a água da torneira, peróxido de hidrogênio 3%, duas lavagens de água destilada, o etanol 70% e duas lavagens mais com água destilada. Blot-seque a carrapatos em toalhas de papel. Contar os carrapatos em grupos de 20 a 50, dependendo do experimento, coloque os carrapatos de cada grupo em um copo de plástico 1,25 onças com uma tampa bem ajustada e etiqueta com o número do grupo experimental. 2.2. Tick ​​equipe de injeção. A equipe de RNAi consiste em três pessoas: (1) uma pessoa que posições cada instante em fita adesiva dupla afixada a uma folha de cera dental vermelho, (2) uma pessoa que injeta os carrapatos e (3) uma pessoa que monitora os carrapatos após injeção, respira de CO 2 na carrapatos para ativá-las e conta os carrapatos que vivem em copos marcados com o número do grupo experimental. Todos os membros da equipe devem usar luvas descartáveis. 2.3. Colocação de carrapatos injectável. Captura de um carrapato com pinças Dumont fina e colocá-lo lado ventral em fita adesiva dupla aposta num 3 "x 6" folha de cera dental vermelho. Os carrapatos estão intimamente posicionados juntos em grupos de 5 carrapatos. Coloque uma pequena tira de fita adesiva sobre o aparelho bucal de todos os cinco carrapatos, a fim de diminuir as deles, mas deixando a maior parte do corpo exposto para que o processo de injeção pode ser observado pelo carrapato injetor (Figura 1). 2.4. Injeção de carrapatos. Os carrapatos serão injetados no quadrante inferior direito da superfície ventral do exoesqueleto. Primeiro, faça um furo no exoesqueleto usando uma seringa de insulina Monoject equipado com um ½ ", agulha de calibre 29 (Figura 2a). Injetar carrapatos imediatamente com 0,2-0,5 mL de solução de dsRNA (5 x 10 10 – 5 x 10 11 moléculas por mL), utilizando uma custom-made seringa Hamilton com uma polegada de 1, 33 agulha com um ponto de 45 ° chanfrado (Figura 2b) . A agulha deve ser colocada bem na cavidade carrapato para assegurar a colocação e retenção do dsRNA. Algum fluido é provável que escapar do local da injeção (Figura 2c). Cuidados devem ser tomados para não mais de injetar os carrapatos, o que causaria perda de hemolinfa e pode causar a morte do carrapato. Limpe a seringa Hamilton depois de completar as injeções em cada grupo experimental. antes de usar para outro grupo experimental. Encha a seringa primeira de um copo contendo peróxido de hidrogênio 3% e, em seguida, expelir em um recipiente de resíduos, e repita 15 vezes. Encha a seringa de um copo contendo água estéril e, em seguida, expelir em um recipiente de resíduos, e repita 15 vezes. Tome cuidado para não dobrar o êmbolo da seringa de Hamilton, porque, se dobrado, o êmbolo não irá mover-se suavemente e responder ao toque suave necessária para injeção de carrapatos. 2.5. Tratamento de carrapatos após a injeção. Pegar o carrapato injetado imediatamente a partir da fita adesiva dupla com a pinça fina e colocá-lo em um recipiente de recuperação de plástico (cerca de 6 "x 6" e cercado com fita adesiva para evitar o escape dos carrapatos). Os carrapatos serão brevemente inativos após a injeção, mas deverá em breve começar a engatinhar ao redor do prato. Respiração CO 2 para os carrapatos imediatamente após colocá-los no recipiente de recuperação para ajudar a ativar os carrapatos. Uma vez que os carrapatos estão rastejando e ativa, a ferida vai curar injeção rapidamente e eles provavelmente irão sobreviver. Contar os ticks de acordo com o número em cada grupo experimental e os coloque em um copo de plástico rotulados com uma tampa bem equipado. Carrapatos substituição deve ser injetado para substituir qualquer que qualquer morreu antes de injetar o próximo grupo experimental. 2.6. Tick ​​exploração. Coloque os carrapatos em uma câmara de umidade (12h de luz: 12 hr fotoperíodo escuro, a 22-25 ° C e 95% em relação humidity) e segure por um dia. Carrapatos lugar no carrapato-alimentação células, uma por grupo experimental, colada a uma ovelha e permitir-lhes para se alimentar com um número igual de uninjected carrapatos masculina ou feminina (o que o sexo não foi injetado). Carrapatos fêmeas que se alimentam de reposição, aqueles que são retirados da ovelha após 10 dias de alimentação, ou quando as fêmeas controle têm deixado o anfitrião são coletados e pesados. Coloque os carrapatos em caixas de cartão, e segure a câmara de umidade até a conclusão de oviposição. Avaliar oviposição pela ponderação das massa de ovos produzidos por todos os carrapatos no grupo. 2.7. Análise do fenótipo tick após RNAi. Avaliar carrapato fenótipo após a alimentação, determinando o número de carrapatos que sobreviveram, peso carrapato, oviposição e fertilidade dos ovos. No entanto, outras análises podem ser realizadas, dependendo do gene-alvo e objetivos do estudo. 3. Análise para confirmar o silenciamento do gene por RT-PCR. Dissecar as glândulas salivares e tripas de carrapatos individuais de grupos de controle de injeção e dsRNA injetado após a alimentação. Extrato de RNA total de amostras de tecido individual. Analisar as transcrições gene alvo nos tecidos individuais por real-time RT-PCR e normalizar os níveis de RNA contra o 16S rRNA tick usando o método genNorm (método ddCT implementada pelo Bio-Rad iQ5 Standard Edition, versão 2.0). Executar curvas de dissociação no final da reação para garantir que apenas um amplicon é formada e que a desnaturar amplicons consistentemente na faixa de temperatura mesmo para cada amostra. Comparar os níveis de mRNA (valores normalizados Ct) entre o controle com injeção e dsRNA injetado carrapatos usando o Student `s t-test (P = 0,05). 4. Resultados representativos: O protocolo aqui descrito tem sido utilizado em nosso laboratório para RNAi em muitas diferentes espécies de carrapatos ixodídeos (Tabela 1). A quantidade de dsRNA injetado no carrapatos varia com o tamanho do carrapato; espécies maiores carrapato pode acomodar um grande volume. Carrapatos controle negativo deve ser injectado com um dsRNA não relacionados. DsRNAs diversas, tais como subolesin 14-19,22-25,27-32,34 e beta-actina 20,21 pode ser usado como controle positivo. Note que é importante lavar a seringa entre os tratamentos para evitar soluções de mistura dsRNA. Se o protocolo for feito corretamente, menos de 5% de mortalidade deve ser obtido a partir do procedimento de injeção após 24 horas. Um fenótipo típico após knockdown do gene em carrapatos é mostrado na Figura 3, com um painel de carrapatos injetados com piscinas de dsRNA, a fim de tela para assinalar antígenos protetores. Tick ​​espécies dsRNA injetado Referências Scapularis Ixodes biblioteca de cDNA, subolesin, actina, nucleotidase, NF-kB, akirin 21, 22, 29, 30 Dermacentor variabilis subolesin, GST, ubiquitina, vATPase, selenoproteínas M e W2a, tronco hematopoiéticas / progenitoras proteína-like, actina subunidade 26S Proteassoma, ferritin1, varisin, akirin 15, 19, 22, 24, 26, 30-32 Dermacentor marginatus subolesin 22 Amblyomma americanum biblioteca de cDNA, subolesin, akirin 17, 22, 30 Amblyomma hebraeum subolesin, voraxin 28 Rhipicephalus sanguineus Rs86, subolesin 22, 23 Rhipicephalus microplus GST, ubiquitina, selenoproteína, Bm86, Bm91, subolesin, GI, GIII, EF1a, flagelliform proteína de seda, von Willebrand fator 16, 18, 25, 27 Annulatus Rhipicephalus ubiquitina, subolesin, EF1a, GIII 16 Tabela 1. Tick espécies em que o protocolo de RNAi tem sido utilizado. Figura 1. Colocação de carrapatos, o lado ventral para cima, sobre fita adesiva dupla adere a uma folha de cera dental vermelho. Os carrapatos são colocados em grupos de 5, após o qual uma pequena tira de fita adesiva é colocada sobre o aparelho bucal, a fim de proteger ainda mais os carrapatos, permitindo que o injector para observar o corpo do carrapato durante a injeção. Figura 2. O procedimento de injeção inclui (a) perfuração no quadrante inferior direito do exoesqueleto do carrapato com uma insulina de syringe com uma agulha calibre 29, a fim de criar um local da injeção, (b) a injeção imediata do dsRNA neste site, utilizando uma seringa Hamilton com uma agulha de calibre 33, que (c) muito provavelmente vai resultar em algum vazamento de hemolinfa carrapato / fluidos. Figura 3. Um painel de carrapato seis grupos em que RNAi foi utilizado para triagem de antígenos carrapato Amblyomma americanum protetora em. As mudanças fenotípicas em carrapatos pode ser visto quando comparado com o positivo subolesin RNAi controle eo controle dsRNA negativas não relacionadas. Neste experimento o efeito do RNAi na mortalidade carrapato, pesos e oviposição de cada grupo foram analisados ​​estatisticamente.