RNA התערבות קרציות

1. דור dsRNA. לסנתז פריימרים oligonucleotide המכיל רצפים T7 האמרגן עבור ב שעתוק במבחנה סינתזה של dsRNA (לדוגמה, עבור Dermacentor variabilis subolesin להשתמש primers oligonucleotide D8AAT75: 5'-TAATACGACTCACTATAGGGTACTGACTGGGATCCCCTGCACAGT-3 'ו D8DVT73: 5'-TAATACGACTCACTATAGGGTACTCGAGCTTGGTGGAAAGGACG-3 "). Amplify גן היעד על ידי RT-PCR באמצעות 10 pmol של פריימר כל oligonucleotide ו 1-10 ננוגרם של רנ"א סך לתקתק. לטהר את מוצר ה-PCR. לסנתז dsRNA באמצעות 8 μL של המוצר מטוהרים PCR. לכמת dsRNA ידי ספקטרומטריית. 2. הזרקה של קרציות עם dsRNA. 2.1. הכנת קרציות להזרקה. ראשית, לשטוף את קרציות בסדרה של פתרונות על ידי רועדת להם פתרון כל שפופרת 50 מ"ל צנטריפוגה חד פעמיות, decanting הפתרון באמצעות מסך חוט דק רשת מעל הצינור כדי לשמור על קרציות. רצף של פתרונות קרציות הכביסה מי ברז, מי חמצן 3%, שני שוטפת של מים מזוקקים, אתנול 70% ושני שוטף יותר עם מים מזוקקים. כתם יבש קרציות על מגבות נייר. הרוזן קרציות לקבוצות של 20 עד 50, תלוי בניסוי, המקום קרציות מקבוצה כל כוס פלסטיק 1.25 גרם עם מכסה מתאים בחוזקה תווית עם מספר קבוצת הניסוי. 2.2. סמן צוות ההזרקה. צוות RNAi מורכבת משלושה אנשים: (1) אדם אחד עמדות כל סמן על סרט דביק כפול מודבקת פיסת שעווה שיניים אדום, (2) אדם אחד מזריק את קרציות ו (3) אדם אחד המסכים קרציות לאחר זריקה, נושם CO 2 על קרציות כדי להפעיל אותם וסופר את קרציות החיים לתוך כוסות תווית עם מספר קבוצת הניסוי. כל חברי הצוות חייבים ללבוש כפפות חד פעמיות. 2.3. המיקום של קרציות להזרקה. לכידת סמן באמצעות מלקחיים דומון בסדר למקם אותו בצד הגחון על סרט דביק כפול מודבקת גיליון 3 "x 6" של שעווה שיניים אדום. קרציות ממוקמים יחדיו בקבוצות של 5 קרציות. מניחים רצועה קטנה של דבק על גפי כל 5 קרציות כדי לקדם לרסן אותם, אך תוך השארת רוב הגוף חשוף כל כך את תהליך ההזרקה ניתן לצפות על ידי סמן ההזרקה (איור 1). 2.4. הזרקה של קרציות. קרציות יהיה להזריק ברבע הימני התחתון של משטח הגחון של שלד חיצוני. ראשית, לנקב חור שלד באמצעות מזרק אינסולין Monoject מצויד ½ ", 29 מחט מד (איור 2 א). הזרק קרציות מיד עם μL 0.2-0.5 פתרון dsRNA (5 x אוקטובר 10-05 x 10 11 מולקולות לכל μL) באמצעות מזרק מחוייט עם המילטון 1 אינץ, 33 מחט מד עם נקודה 45 ° משופעים (איור 2b) . המחט צריך להיות ממוקם היטב לתוך חלל סמן כדי להבטיח את המיקום ושמירה של dsRNA. נוזל חלק עשוי להימלט מן הזריקה (איור 2 ג). יש להקפיד לא על להזריק את קרציות, אשר יגרום לאובדן hemolymph ועלולה לגרום למותם של סמן את. נקה את המזרק המילטון לאחר סיום זריקות בכל קבוצה ניסיונית. לפני השימוש עבור קבוצה אחרת ניסיונית. מלאו את המזרק הראשון כוס המכילה מי חמצן 3% ולאחר מכן לגרש לתוך מיכל פסולת, וחזור 15 פעמים. מלאו את המזרק מתוך כוס המכילה מים סטריליים ואז לגרש לתוך מיכל פסולת, וחזור 15 פעמים. הקפד לא לכופף את הבוכנה של המזרק המילטון, כי אם כפופות, הבוכנה לא יעברו בצורה חלקה להגיב למגע עדין נדרש הזרקה של קרציות. 2.5. טיפול קרציות לאחר ההזרקה. תרימי את סמן מוזרק מיד מהקלטת דביק כפול עם מלקחיים בסדר להניח אותו במיכל פלסטיק התאוששות (כ 6 "x 6" ועטור דבק כדי למנוע בריחה של קרציות). קרציות יהיה פעיל לזמן קצר לאחר ההזרקה, אבל צריך בקרוב להתחיל לזחול סביב המנה. נשימת CO 2 על קרציות מיד לאחר הצבתם במכולה התאוששות כדי לסייע להפעיל את קרציות. לאחר קרציות הן זחילה פעיל, הפצע יתרפא זריקה במהירות והם סביר להניח לשרוד. הרוזן קרציות לפי מספר בכל קבוצה ניסיוניים ולמקם אותם בכוס פלסטיק עם מכסה שכותרתו צפופות. קרציות החלפת צריך להיות מוזרק להחליף כל שכל נפטר לפני הזרקת קבוצת הניסוי הבא. 2.6. סמן מחזיק. מניחים את קרציות בתא לחות (12hr אור: 12 שעות photoperiod כהה 22-25 ° C ו 95% h יחסיתumidity) והחזק ליום 1. קרציות מקום קרציות האכלה תאים, אחד לכל קבוצת הניסוי, דבוק כבשה ולאפשר להם להאכיל עם מספר שווה של קרציות זכר או נקבה uninjected (לפי המין לא היה מוזרק). קרציות נקבה כי להאכיל את גודש, אלה יוסרו מן הכבשים לאחר 10 ימים של האכלה או כאשר הנקבות לשלוט כבר הוריד את המארחת נאספים שקל. מניחים את קרציות בקרטונים, והחזק בתא לחות עד השלמת ההטלה. הערכת ההטלה על ידי שקלול המוני ביצים המיוצר על ידי כל קרציות בקבוצה. 2.7. ניתוח של פנוטיפ סמן לאחר RNAi. הערכת סמן פנוטיפ לאחר האכלה על ידי קביעת מספר קרציות ששרדו, משקל סמן, ההטלה והפוריות ביצה. עם זאת, ניתוחים אחרים עשויים להתבצע בהתאם הגן לבין מטרות ממוקדות של המחקר. 3. ניתוח לאשר השתקת הגן על ידי RT-PCR. לנתח בלוטות הרוק ואת האומץ של קרציות בודדים מקבוצות שליטה הזריק ו-dsRNA מוזרק לאחר ההנקה. תמצית RNA הכולל דגימות רקמה בודדים. ניתוח תעתיקי גנים ברקמות יעד שונות על ידי זמן אמת RT-PCR ו לנרמל את רמות RNA נגד 16S rRNA סמן בשיטת genNorm (שיטת ddCT כמו מיושם על ידי Bio-Rad iQ5 Standard Edition, גרסה 2.0). הפעל עקומות דיסוציאציה בסוף התגובה על מנת להבטיח כי רק אחד amplicon נוצר וכי לפגל amplicons עקבי בטווח הטמפרטורה זהה עבור כל מדגם. השווה את רמות ה-mRNA (מנורמל לערכי CT) בין שליטה הזריק ו-dsRNA מוזרק באמצעות קרציות הסטודנטים `s t-test (p = 0.05). 4. נציג תוצאות: פרוטוקול המתואר במסמך נעשה שימוש במעבדה שלנו RNAi ב שונה מינים רבים סמן ixodid (טבלה 1). כמות dsRNA מוזרק קרציות משתנה עם גודלו של סמן את; מינים סמן גדול יכול להכיל נפח גדול יותר. קרציות שליטה שלילי צריך להיות מוזרק עם dsRNA שאינו קשור. DsRNAs מספר כגון subolesin 14-19,22-25,27-32,34 ו בטא אקטין 20,21 יכול לשמש שולטת חיובית. שים לב, חשוב לשטוף את המזרק בין הטיפולים, כדי למנוע ערבוב פתרונות dsRNA. אם הפרוטוקול הוא נעשה בצורה נכונה, פחות מ 5% תמותה יש לקבל זריקה ההליך לאחר 24 שעות. פנוטיפ אופייני אחרי מציאה גן קרציות מוצג באיור 3 עם פאנל של קרציות מוזרק עם בריכות של dsRNA כדי המסך סמן אנטיגנים מגן. סמן מינים dsRNA מוזרק הפניות קרצית scapularis ספריית cDNA, subolesin, אקטין, nucleotidase, NF-kB, akirin 21, 22, 29, 30 Dermacentor variabilis subolesin, GST, היוביקוויטין, vATPase, selenoproteins M ו W2a, hematopoietic גזע / ובתאים דמוי חלבון, למקטע אקטין פרוטאזום 26S, ferritin1, varisin, akirin 15, 19, 22, 24, 26, 30-32 Dermacentor marginatus subolesin 22 Amblyomma americanum ספריית cDNA, subolesin, akirin 17, 22, 30 Amblyomma hebraeum subolesin, voraxin 28 Rhipicephalus sanguineus Rs86, subolesin 22, 23 Rhipicephalus microplus GST, היוביקוויטין, selenoprotein, Bm86, Bm91, subolesin, העיכול, GIII, EF1a, חלבון flagelliform משי, von Willebrand גורם 16, 18, 25, 27 Rhipicephalus annulatus היוביקוויטין, subolesin, EF1a, GIII 16 טבלה 1. טיק מינים שבהם פרוטוקול RNAi כבר בשימוש. באיור 1. המיקום של קרציות, בצד הגחוני מעלה, בקלטת דביק כפול דבק גיליון של שעווה שיניים אדום. קרציות מוצבים בקבוצות של 5, לאחר מכן רצועה קטנה של דבק מונח על גפי על מנת להבטיח את המשך קרציות תוך מתן מזרק כדי לשמור על הגוף במהלך סמן את הזריקה. איור 2. ההליך כולל הזרקה (א) פירסינג ברבע הימני התחתון של שלד חיצוני לתקתק עם אינסולין סאיringe מצויד במחט 29 מד כדי ליצור אתר הזרקה, (ב) הזרמה מיידית של dsRNA באתר זה בעזרת מזרק עם מחט המילטון 33 מד אשר (ג) קרוב לוודאי תגרום לדליפת חלק hemolymph סמן / נוזלים. איור 3. פאנל של שש קבוצות סמן שבו RNAi שימש המסך אנטיגנים סמן המגן Amblyomma americanum. השינויים פנוטיפי ב קרציות ניתן לראות בהשוואה חיובי subolesin RNAi מלאה שליטה שלילי dsRNA קשור. בניסוי זה ההשפעה של RNAi על התמותה סמן, משקולות, ו ההטלה של כל קבוצה נותח סטטיסטית.