日立F - 7000蛍光分光光度計とPicoGreen色素を使用してdsDNAの定量化

1。楽器のセットアップ蛍光分光光度計の電源を入れ、1時間ウォームアップ。 Excelは、図1に示すように、標準およびサンプルデータを持つファイルを作成し、そのコンマで区切られた値"CSV"形式で保存する方法。 図1。スタンダードとサンプルデータ。 次のように蛍光光度計を設定します。 をクリックしてくださいボタン、これは図2に示すように解析手法のウィンドウが、開きます。 図2。分析法のウィンドウ、[全般]タブ。 次のように選択します。 "測定"フィールドで、プルダウンメニューから測光を選択します。 "オペレータ"フィールドで、適切な演算子の名前を入力します。 "インストゥルメント"フィールドに情報を入力する必要はありません。これは、ソフトウェアによって自動的に選択されます。 マイクロプレートリーダーを使用する場合は"サンプリング"フィールドは非アクティブです。 あなたが"コメント"フィールドに、レポートに含めることができる任意のコメントを入力してください。 "アクセサリー"フィールドに、このテストのために使用されるアクセサリーに関連する情報を入力してください。 ウィンドウの右側のボタンに注意してください。 "読み込み"ボタンをクリックすると、以前に保存された分析メソッドをロードすることができます。 "Save"ボタンは、同じ名前を使用して、以前に保存し、ロードテストパラメータや解析手法のセットを更新できます。 ボタンは任意の名前の下に、テストパラメータや解析手法の新しいセットを保存できる"名前を付けて保存"。 今、"定量化"タブをクリックします（図3参照）と次の選択を行います。 図3。分析法の窓、定量タブ。 "定量のタイプ"フィールドでは、波長を選択します。これは、蛍光読み取りが選択された波長を使用して行われることを示します。 "キャリブレーションのタイプ"フィールドで、1回目の順番を選択します。 "波長の数"フィールドに、1を選択します。 "濃度の単位"フィールドで、ng / mLを入力してください。 "マニュアルキャリブレーション"と"ゼロを介してフォースカーブ"のチェックボックスを選択しないままにします。 フィールド"小数点以下の桁"で、2を選択します。 "低濃度の上限"フィールドで、0を入力します。 "アッパー濃度限界のフィールドでは、10000を入力します。 今すぐ"インストゥルメント"タブをクリックし、次の選択を行います。 図4。分析法のウィンドウ、インストゥルメント]タブ "データモード："フィールドで、蛍光を選択します。 "チョッピング速度"フィールドはこの時点で非アクティブになって、それはリン光測定のためにのみ使用されます。 "波長モード"フィールドでは、どちらのWLの固定]を選択します。 "EX / WL1"フィールドに480nmと入力します。 "EM / WL1"フィールドでは520nmを入力してください。 他のすべてのEXの下のフィールドとEMはこの時点で非アクティブです。 "EXスリット"フィールドで、プルダウンメニューから5.0nm]を選択します。 "EMスリット"フィールドで、プルダウンメニューから5.0nm]を選択します。 "PMT電圧1 – 1000V"フィールドの前にあるボックスを選択しないままにします。 "PMT電圧"フィールドで、プルダウンメニューから700Vを選択します。 の"自動統計のcalc。番号"フィールドを選択します2。 "レプリケート"フィールドで1を選択します。 "積分時間"フィールドでは0.1秒を選択します。</ LI> "遅延"フィールドに入力するか、または0を選択します。 "モニタ"タブをクリックします。 図5。分析法のウィンドウ、[モニタ]タブ。 フィールドを選択10000："Y軸"、"マックス"の "Y軸"で、"最小："フィールド、0を選択します。 "データ収集後のオープンデータの処理"の左側にあるボックスを選択します。 もし測定値が完了した後に自動的に印刷するレポートを必要とする場合を除き、"データ取得後のレポート印刷"の左にあるボックスを選択しないままにします。 "レポート"タブをクリックし、図6を参照してください。 図6。分析法のウィンドウ、レポートタブ。 "出力"フィールドで、プルダウンメニューからレポートの印刷]を選択します。また、カスタムメイドのレポートを生成できるようにするプログラムのレポート生成プログラムで、オプションのアドインを使用する場合は、"印刷ジェネレータシートを使用して、"Excelにエクスポートされたデータが必要な場合は、"Microsoft Excelを使用する"、または選択することもできます。 レポートに含まれるようにしたい項目のチェックボックスをクリックしてください。 "分析方法"ウィンドウの別のタブで選択されたすべてのパラメータを保存するには、""全般"タブを再度クリックし、ファイル名の下にし、将来の使用のためにそれらを見つけるような場所に保存し、クリックします。 OK"このウィンドウを閉じるためのボタン。 これにより、機器の試験パラメータの設定は完了です。 今我々はマイクロプレートリーダーを設定します。 をクリックしてください上にMPR Setupウィンドウをもたらすボタン、。 図7に示すように、MPR設定画面/プレートタブの標準とサンプルのための井戸を、選択してください。 図7。 MPR Setupウィンドウ、プレートタブ。 A1の位置をクリックして、E1にマウスをドラッグし、次にをクリックしてくださいボタン。これは、標準に使用される位置を選択します。それらの位置は、緑の色で強調表示されます。 今、私たちは、サンプルのH3にF1の位置を選択する必要があります。をクリックしてクリックし、位置のF1で起動するマウスをドラッグして、H3の位置をするとボタン、これは黄色の色でそれらの位置が強調表示されます。 その後、サンプルの測定のためのそれらの位置を選択するには、E3にA2の位置に対して同じ操作を繰り返します。 今、標準とサンプルの情報と予め用意された変数（CSV）ファイル区切りファイルのカンマをロードしてみましょう。 図8に示すように、"MPR Setup]ウィンドウ"、の"まあ情報"タブをクリックします。 図8。 MPR Setupウィンドウ、きちんとした情報]タブ。 次にをクリックしてくださいボタン。 Windowsエクスプローラのウィンドウには、"まあinformation.csv"ファイルを探し、それをロードできるようになりますれ、図9に示すように、どのように表示されます。 図9。サンプルウェルの情報をロード。 "まあ情報"ファイルをロードした後、"まあ情報は、"図10に示すようになります 図10。サンプルも情報をロードしました。 2。 Picogreenアッセイサンプルの準備 20 × TEバッファー1mlを加えることによって1 × TEバッファー（10mMトリス- HCl、1mMのEDTA）を準備〜19 mLののdI H 2 O 9.95 mLの1 × TEバッファーに50μlの200 X PicoGreen試薬を添加することによりPicoGreen試薬溶液を準備します。 株式鎖DNA（100μg/ mLの）の段階希釈を行うことによって基準（ラムダdsDNAを）準備する。最初の株式のdsDNA（100μg/ mL）を、25μLの1 × TEバッファー25μLを加えることによって50μg/ mlのdsDNAの溶液を調製。次に、以下の表に示すように二本鎖DNAとバッファの指定されたボリュームを追加することによって、標準溶液を調製。 dsDNAの濃度 dsDNAの体積 Bufferの量 1μg/ mlの 50μg/ mlのdsDNAの20μL 980μLの1 × TEバッファーは0.1μg/ mLの 1μg/ mlのdsDNAの100μL 900μL1 X TEバッファー 0.01μg/ mLのは0.1μg/ mLのdsDNAの100μL 900μL1 X TEバッファー 0.001μg/ mLの 0.01μg/ mLのdsDNAの100μL 900μL1 X TEバッファー 3。スタンダードとサンプルの蛍光の測定ピペット150 96ウェルプレートのウェルA1 – E1にそれぞれ標準のμL、図7に当たり、および次の表によると： も標準的な A1 1μg/ mlの B1 は0.1μg/ mLの C1 0.01μg/ mLの D1 0.001μg/ mLの E1 1 X TEバッファー図7に示すように、H3に井戸F1ピペット150μLの未知試料、 マルチチャンネルピペットを使用するように設計された溝にステップ1.2で作成したPicoGreenソリューションを注ぐ。井戸A1 – H3〜150μLPicoGreenソリューションを提供するためにマルチチャンネルピペットを使用してください。静かにピペットで混合液と標準。 場所は、暗い領域でプレートと開発するために反応のために2〜5分待ちます。 4。代表的な結果良好な検量線は、ソフトウェアによる検量線の基準と計算の測定時にF – 7000のソフトウェアが提供する様々なパラメータを用いて評価されます。 決定係数は、測定基準の適合度と計算された検量線を示します。近いこの値は測定値と検量線のフィットより、"1"になります。 値が"1"から離れている場合、基準は、再測定を再度準備、または検量線のフィットネスは、変更する必要があります。 図11は、PicoGreen色素を使用してdsDNAの定量化のために得られる計算された決定係数= 0.99993、と検量線の例を示しています。 図11。本鎖DNAの検量線の例。