Quantificação de dsDNA usando a Hitachi F-7000 Espectrofotômetro de Fluorescência e PicoGreen Dye

1. Configuração do Instrumento Ligue o espectrofluorímetro e deixe aquecer por 1 hora. Usando o Excel cria um arquivo com as Normas e os dados da amostra, como mostrado na Figura 1 e salve-o em comma separated values ​​"csv" formato. Figura 1. Padrões e dados de amostras. Configurar fluorímetro da seguinte forma: Clique na botão, isto irá abrir a janela de Método de Análise, mostrado na Figura 2. Figura 2. Janela Método de Análise, na guia Geral. Faça as seguintes seleções: Na "medição" de campo, selecione Fotometria do menu suspenso. Em "Operador", digite o nome do operador apropriado. Não há necessidade de inserir informações no "Instrumento" campo. Esta é selecionado automaticamente pelo software. A "amostragem" de campo é inativa quando se utiliza o leitor de microplacas. Digite comentários que você pode querer incluir no relatório no campo "Comentários". No "acessório" de campo, insira as informações relacionadas com os acessórios utilizados para este teste. Nota os botões do lado direito da janela. O botão "Load" permite carregar Métodos de Análise salvo anteriormente. O botão "Salvar" permite a atualização de um conjunto de parâmetros de teste ou método de análise anteriormente salvo e carregado, usando o mesmo nome. O "Salvar como" botão permite salvar um novo conjunto de parâmetros de teste ou Método de Análise com um nome desejado. Agora clique em "quantificação" guia, veja a Figura 3 e faça as seguintes seleções. Figura 3. Janela Método de Análise, guia quantitativa. No "A determinação quantitativa do tipo" campo, selecione Wavelength. Isto indica a leitura de fluorescência será feita utilizando o comprimento de onda selecionado. Na "calibragem" tipo de campo, selecione 1 ª ordem. No "Número de comprimentos de onda" de campo, selecione 1. Na "Concentração unidade" de campo, entrar ng / mL. Deixe desmarcado as caixas para "Manual de Calibração" e "Força através da curva de zero". No "Digit após ponto decimal" campo, selecione 2. Na "Baixa-limite de concentração", digite 0. No campo limite "superior de concentração, digite 10000. Agora clique em "Instrumento" guia e faça as seguintes seleções. Figura 4. Janela de análise do método, guia Instrumento No "modo de dados:" campo, selecione Fluorescência. O "Chopping velocidade" campo está inativo no momento, ele é usado somente para medições de fosforescência. No "modo de comprimento de onda" de campo, selecione Ambos fixo WL. Na "EX / WL1" field entrar 480nm. No "EM / WL1" field entrar 520nm. Todos os outros campos sob EX e EM estão inativos no momento. Na "EX fenda" campo selecione 5.0nm do menu suspenso. No "EM fenda" campo selecione 5.0nm do menu suspenso. Deixe desmarcada a caixa na frente da "Tensão PMT 1-1000V" campo. No "PMT Voltage" campo, selecione 700V do menu suspenso. No "Auto calc estatística. Número" campo selecione 2. No "Replica" campo selecione 1. No "tempo de integração" campo selecionar 0.1s. </ Li> No "Delay" campo de digitar ou selecionar 0s. Clique no separador "Monitor". Figura 5. Janela de análise do método, guia Monitor. No "eixo Y", "Max:" campo, selecione 10000 No "eixo Y", "Min:" campo, selecione 0. Selecione a caixa à esquerda do "Aberto de processamento de dados após a aquisição de dados". Deixe desmarcada a caixa à esquerda do "relatório de impressão depois de aquisição de dados", a menos que você queira um relatório a ser impresso automaticamente após as leituras sejam concluídas. Clique no botão "Report" guia, veja a Figura 6. Figura 6. Janela de análise do método, guia do relatório. Na "saída" de campo, selecionar Imprimir relatório do menu suspenso. Você também pode selecionar "Use Microsoft Excel" se você deseja que os dados exportados para o Excel, ou "Use Folha Generator Imprimir" se estiver usando o suplemento opcional no Gerador de Relatórios programa que permitirá gerar relatórios personalizados feitos. Clique nas caixas para os itens que você quer ser incluído no relatório. Para salvar todos os parâmetros selecionados nas diferentes guias do "Método de Análise" janela, clique novamente na guia "Geral" e salvá-las sob um nome de arquivo e em um local onde você pode encontrá-los para uso futuro, e clique no botão " OK "para fechar esta janela. Isso completa a criação de parâmetros de teste do instrumento. Agora vamos configurar o leitor de microplaca. Clique na botão, que trará a janela de configuração do MPR em cima. Selecione poços para os Padrões e amostras na guia Configurar MPR Window / Plate, como mostrado na Figura 7. Figura 7. MPR janela de instalação, guia Plate. Clique na posição A1 e arraste o mouse para E1, em seguida, clique na botão. Isso irá selecionar as posições a serem utilizados para os padrões. Essas posições será destaque na cor verde. Agora, precisamos selecionar as posições a F1 H3 para as amostras. Clique e arraste o mouse a partir de F1 posição, a posição H3 e depois clique no botão, isto irá destacar as posições na cor amarela. Em seguida, repita a mesma operação para os cargos de A2 E3, para selecionar as posições para medições da amostra. Agora, vamos carregar o arquivo Comma Separated arquivo (csv) Variável preparado com antecedência com as Normas e informação de amostra. Clique no botão "Bem informações" guia da "janela de configuração do MPR", como mostrado na Figura 8. Figura 8. MPR janela de instalação, guia de informação bem. Em seguida, clique na botão. Uma janela do Windows Explorer será aberto que, como mostrado na Figura 9, o que permitirá localizar o "Bem information.csv" arquivo e carregá-lo. Figura 9. Carregando informações de amostra bem. Depois de carregar o "Bem informações" arquivo, a "informação Bem" vai olhar como mostrado na Figura 10 Figura 10. Carregado de informações de amostra bem. 2. Picogreen Preparação de amostras de Ensaio Prepare 1X tampão TE (10 mM Tris-HCl, 1 mM EDTA), adicionando 1 mL de 20 X tampão TEa 19 mL dI H 2 O. Prepare PicoGreen Solução Reagente pela adição de 50 mL 200 X Reagente PicoGreen para 9,95 1 X mL tampão TE. Elaborar normas (Lambda dsDNA) fazendo diluições em série de ações dsDNA (100 mcg / mL). Primeiro preparar uma solução de 50 mg / mL dsDNA adicionando 25 mL de estoque dsDNA (100 mcg / mL) e 25 mL 1 x tampão TE. Em seguida, preparar as soluções padrão, adicionando os volumes indicados de dsDNA e buffer como listadas na tabela abaixo: Concentração de dsDNA Volume de dsDNA Volume de Tampão 1 mg / mL 20 mL de 50 mcg / mL dsDNA 980 mL 1 X tampão TE 0,1 g / mL 100 L de 1 mg / mL dsDNA 900 mL 1 X tampão TE 0,01 mcg / mL 100 L de 0,1 mcg / mL dsDNA 900 mL 1 X tampão TE 0,001 mg / mL 100 L de 0,01 mcg / mL dsDNA 900 mL 1 X tampão TE 3. Medição de Padrões e fluorescência da amostra Pipetar 150 mL de cada padrão em poços A1-E1 de uma placa de 96 poços, por Figura 7, e de acordo com a tabela a seguir: Bem Padrão A1 1 mg / mL B1 0,1 g / mL C1 0,01 mcg / mL D1 0,001 mg / mL E1 1 X tampão TE Pipetar 150 mL amostras desconhecidas em poços de F1 H3, mostrado na Figura 7 Despeje PicoGreen solução preparada na etapa 1,2 em uma calha projetado para multi-canal de uso da pipeta. Use uma pipeta multi-canal para fornecer solução de 150 mL PicoGreen aos poços A1-H3. Solução de misturar e padrões cuidadosamente com pipeta. Colocar a placa na área escura e esperar 2-5 minutos para a reação para se desenvolver. 4. Resultados representante A curva de calibração bom é avaliado utilizando os diferentes parâmetros fornecidos pelo software F-7000 em cima da medida das normas e cálculo da curva de calibração pelo software. O coeficiente de determinação indica a qualidade do ajuste dos padrões de medida e calculada a curva de calibração. Quanto mais próximo este valor é "1", melhor o ajuste do valor medido e curva de calibração. Se o valor está longe de "1", as normas devem ser reavaliados, preparado novamente, ou a adequação da curva de calibração mudou. A Figura 11 mostra um exemplo de uma curva de calibração com um coeficiente de determinação calculado = 0,99993, obtidos para a quantificação de dsDNA usando PicoGreen corante. Figura 11. Exemplo de dsDNA curva de calibração.