Teşhis ve Tedavi İzleme Nanomalzemelerin Kayıtlı bio

1. Giriş Ilaç ve tedavi makromoleküllerin (peptidler, proteinler ve nükleik asitler), aktif hastalık ve devam eden mikrobik enfeksiyonlar hücresel ve doku sitelerine seçici teslim hastalık 1-3 sırasında ilaç yanıtları artıracaktır . Belirli bir hücresel site yapan, son derece mobil ve bağışıklık ve insan immün yetmezlik virüsü (HIV) için tutarlı bir temel hedefi olan makrofaj 4 önemlisi, makrofaj meşgul inflamasyon aynı zamanda dejeneratif, inflamatuar, enfeksiyöz içeren geniş bir yelpazede bozukluklarının altında yatan ve kanser hastalıkları ve hücre doku yaralanmaları hastalık 5-9 siteleri temelini ilerlemesi için hareket. Daha da önemlisi, ilaç, makromolekül ve sinyal taşıyıcıları gibi kan yoluyla bulaşan makrofajların translasyonel potansiyeli için son bir ilgi görmüştür. Ancak, terapötik potansiyelleri gerçekleştirilmesinde önemli bir tıkanıklığı, kan beyin bariyerini (BBB) ​​makromoleküllerin ve proteinlerin bir spektrum geçirmez olan diğer doku engelleri arasında. Bu, bariyerler, yine de, hücre geçişine izin yok. Bypass engelleri enfeksiyon veya inflamasyon sitelerine formüle ilaçlar, keçeli kalem ve peptitler taşıyabileceği hastalığı periferik makrofajların doğal seyri içinde hep birlikte tahmin edilmektedir. Bununla birlikte, bu tür teknolojilerin geliştirilmesinde kalır. Çalışmaları ile hücre-aracılı teslimat, insan hastalıklarına 10-12 laboratuvar ve hayvan modellerinde tarafından desteklenen tanı ve tedavi uygulamaları ve bu uygulamalar için geliştirilmiş olabilir . 2. Nanomalzemenin Hazırlıkları Ilaç dağıtım ve biodistribution çalışmaları için nanomalzemelerin hazırlanması, bu konuda paralel bir el yazması (referans paralel el yazması) bir konudur. Laminer akış kaputu kristal nanoparçacık üretimi için tüm işlemler yürütülmektedir. Tüm yüzeyler% 70 alkol ile kullanımdan önce dezenfekte edilmektedir. Bu çalışma yüzeyi, eldiven ve dış dökülen içerir. Tüm mendil ile hemen çoğaltmak% 70 alkol solüsyonu ile kaplıdır. Eldiven kullanıldıktan sonra atılır ve herhangi bir diğer laboratuvar alana girerken giyilen değildir. Prosedürleri için gerektiğinde ilaç yüklü parçacıkların üretimi için / / tüm reaktifleri içeren Yardımcı maddeler, ilaç, steril su sadece çalışma alanları içine getirilir. Steril sarılmış bir biyolojik tehlikeli atık kabı içine pipetler kullanılır ve kullanıldıktan sonra atılır. Islak istekli cihaz kullanımı sonrasında ve öncesinde alkol ile dezenfekte edilir. Çalışma alanı hemen önce ve sonrasında% 70 alkol ile temizlenir. Nanoparçacık çözüm pirojen için FDA kurallarına uygun olarak, hayvanlar için kullanılan ilaç parçacık çözümleri bakteriyel endotoksin yokluğunu değerlendirmek için test edilir. Kısaca, Aday nanoformulations in vivo kullanımı için uygun sürfaktan ile aynı boyuttaki bir parçacık veya kaplama öncesi süperparamanyetik demir oksit (SPIO) öğütülmüş parça ile ilaç çekirdekli veya damlacık değiştirerek çoğaltılır. Bu boyut, şarj, şekil ve sitotoksisite SPIO model sistem aday nanoformulated ilaç olarak aynı özelliklere sahip olup olmadığını belirlemek için tedbirler ile takip edilmektedir. Son olarak, hücre yükleme testleri agar jel askıya etiketli hücreleri oluşur hayaletler kullanarak hücrelerin içinde relaksivite belirlemek amacıyla aday SPIO modeli nanoformultation kuluçka tarafından yapılmaktadır. Hayaletler, üç nüsha olarak hazırlanır ve konsantrasyonlarının bir dizi hücrelerde SPIO alımı nedeniyle relaksivite ölçmek amacıyla hazırlanmıştır. Bu hassasiyet bir dizin sağlar ve dolayısıyla manyetik rezonans görüntüleme (MRI) taramaları SPIO görünürlüğünü nanoformulations oksidasyon durumunu etkiler ve olmadığını belirler. 3. Yöntem ve Usulleri: Hayvan Hazırlık Enjeksiyonlar / kateterler. Ilgi zaman bağlı olarak, enjeksiyon MR içinde hayvan enjekte etmek için bir kateter kullanımı gerekebilir. Kateterler, enjeksiyon hattı ölü alanı en aza indirmek için manyetik olmayan bir iğne ve minimum çap ile bir hortum uzantısı kullanılarak hazırlanmış. Kateter nanomalzemenin bağlı olarak ölü boşluk ve enjeksiyon kabul toplam hacmi, enjekte veya tuzlu olması içeren ya da çözümü ile önceden doldurulmuş olmalıdır. Mümkünse, enjeksiyon, serum fizyolojik floş ile takip edilebilir. Akut kez çok büyük bir öneme sahip değilseniz, bir ön tarama olabilir ve biodistribution önlemler tarar takip önce enjeksiyon mıknatıs dışında önceden belirlenmiş bir zamanda yapılabilir. Kateterler genellikle IV enjeksiyon için kuyruk damar içine eklenir. Anestezi ve izleme. Tarama öncesinde, hayvan anestezi ikna etmek için bir odaya yerleştirilir. Bu hazne n% 70,% 1.5 izofluran ile önceden doldurulmuşitrous oksit ve% 30 oksijen hayvan anestezi başlangıcında hız ve hayvan odasının çıkarıldıktan sonra uyanmak sağlamak için gerekli süreyi en aza indirmek için. Hayvan tamamen uyuşturulduktan sonra, hayvan odasından çıkarılır ve set-up sırasında izofluran sağlamak için devam eden ve tarama sırasında hayvanın nefes oranı ve sıcaklık izlemek için donanımlı stereotaktik sahibi yerleştirilir. Hayvan Sahiplerine ve Uyum Hususlar: Set-up, gözün kornea ülserlerine karşı korumak için yağ içerir. Hayvan, gazlı bez ile hafifçe sarılır ve gazlı bez, tarama sırasında ısı kaybını en aza indirmek ve solunum monitörü karşı pozitif basınç sağlamak için bantlanmış. Hayvan sahipleri, başın dikey ve yatay hizalama için izin ayarlanabilir diş çubukları ile donatılmıştır. Rostral kaudal yönde kafa açılanma manyetik duyarlılık nedeniyle manyetik alan homojen ile ek zorluklara neden olarak, yüksek alan MR için özellikle önemlidir. Manyetik alan homojen yüksek kaliteli T 2 zararlı * 1 H manyetik rezonans spektroskopi (1 H MRS) ve manyetik rezonans difüzyon tensör görüntüleme (DTG) yanı sıra MR. Rostral kaudal yönde kafa açısı uygun konumlandırma ek olarak, baş dönmeler, mümkün olduğu ölçüde kaçınılmalıdır. Mıknatıs hayvan sahibinin dönüş için izin hayvandan hayvana oluşabilir küçük dönmeler, tazminat sağlayacaktır. Bu da hayvan MR sistemi içine yerleştirmeden önce, açılanma baş ve dikkat dikkatli yerleştirme ile minimize edilebilir. Kalibrasyon ve layneri: hayvan sahibinin ve yüzey bobin düzgün kafa yerleştirilir, hayvan başlangıç ​​pozisyonuna rostral kaudal yönde bir gerçek zamanlı tek boyutlu okuma tarafından belirlenir. Sinyal alımı için kullanılan yüzey bobin çevresinde gözlenen dalga formlarının yorumlanması için ihtiyaç sınırlayıcı alanı ile sınırlıdır. Başlangıç ​​konumu belirlendikten sonra, bir 3-düzlem yerelleştiricisinin görüntü tarayıcı hayvanın kesin konumunu belirlemek ve ilgi tarama (ler) için gerekli olan hassas konum hareket için izin alınır. Bu manyetik alan homojenliği ayarlamalarına veya mıknatıs "layneri" tarafından takip edilmektedir. Bu elektromıknatıslar serisi veya alanında homojenlik ayarlamak için tasarlanmış sistem içinde "shim er bobinleri" ölçülen tepkiler dayanan hassas bir şekilde belirlenen mekansal düzeltme alanında dağıtım ve hesaplama haritalama tarafından yapılır. Layneri Dr Hetherington 13 tarafından geliştirilen bir çoklu-gradient eko sekansı ve haritalama yazılımları kullanarak gerçekleştirilir. Homojenlik Bölgeler her bir görüntüleme yöntemi ile incelenen bölgeye eşleştirilir. Bir kez layneri tamamlandıktan hayvan ilgi tarama (ler) satın alabilirsiniz. 4. Veri Toplama Yüksek Çözünürlüklü T 2 ağırlıklı MRG. SPIO içeren nanopartiküller Biodistribution yüksek çözünürlüklü 3D T 2 * ağırlıklı MRG sinyal kaybı bölgeleri tespit ederek tespit edilebilir. Beyin bölgesi yerelleştiricisinin taramaları belirlenir ve gerektiği gibi yerelleştiricisinin taramaları veya ek taramalar reçete edilir. 2 * 150 mikron izotropik çözünürlük ile ağırlıklı MRI tarama AT sonra elde edilir. Yüksek çözünürlüklü 3D gradyan eko MRG fare kafası edinimi parametreleri ile eko zamanı = 5 ms, tekrarlama zamanı = 50 ms,% 30 eko, flip angle = 35 derece, ortalama = 25 mm kuş kafesi ses bobini kullanılarak elde edilir hatırladı 2. Görüş, saha = 20 x 20 x 128 çözünürlüğe sahip 20 mm x 128 x 128 (voksel boyutu = 150 x 150 x 150 mikron 3), toplam satın alma süresi = 30 dk . Difüzyon Tensör Görüntüleme (DTI): Difüzyon tensör görüntüleri, yönü ve doku hücreleri içinde su difüzyon büyüklüğü nicel önlemler. Sonuç olarak, sinyal faz taramaları mikroskobik su hareketi için sensitize veya "ağırlıklı" olarak, hareket son derece duyarlıdır. Sonuç olarak, sinyal bulaşması neden tek çekim satın almalar, satın almalar arasında faz vardiya önlemek için istenen; solunum yolluk ve sinyal alımı sırasında brüt hareket önlemek için gereklidir. Bu nedenle, bir solunum kapılı spin-eko difüzyon ağırlıklı eko planar görüntüleme (EPI), MR dizisi istihdam edilmektedir. Yine, sinyal evrimi sırasında off-rezonans etkileri görüntü düzleminde, konum dolayısıyla sinyal frekansı kayıt hatası neden olur, ve taramaları bölge layneri çok önemlidir. EPI satın alma parametreleri 14 dilim, 200 KHz bant genişliği, 96 x 96, 256 x 256 düzlemde edinimi sıfır dolu ve bir 0.5 mm kalınlığında. Kullanılan difüzyon kodlama, rotasyonel-değişmeyen ve değişen dengeli bir polarite icosahedral şeması (12 DirecAfin grup) 14,15. Kodlama şeması arka plan difüzyon degrade kaplinler 16 azaltmak için tasarlanmıştır. Difüzyon ağırlık b-faktörü = 800 mm -2, δ = 4 ms, Δ = 15 ms, Gdmax = 40 G / cm, 200 uS yükselme zamanı, b = 0 elde etmek için 7 ortalamaları, her b = 800 kodlama için 3 ortalamaları yönü, toplam edinimi süresi 20-40 dakika, solunum hızı bağlı. Lokalize 1 H Manyetik Rezonans Spektroskopisi (1 H MRS): 1 H MRS beyin bölgelerinin aynı görüntüleme oturumu sırasında elde edilen görüntüler üzerinde reçete elde edilebilir. Lokalizasyonu ilgi bölge spektrumları elde etmek için reçete görüntüleri bulundu. Sonra bölgede lokalize bir su spektrumu kullanılarak kontrol layneri satın alma hacmi ile eşleşen bir bölge tanımlanır. Sonra, suya bastırma bakliyat gücünü optimize edilmiş, su frekans rezonans su sinyali sağlamak için ölçülen ve kalite kontrolü sağlamak için kısa bir test spektrumu elde edilir. Spektrumları yetersiz kalite, radyofrekans (RF) güç ve kama ayarları da dahil olmak üzere, sistem ayarları, kontrol edilir. Son olarak, kalitesi hala yeterli değilse, ikinci bir 3-düzlemi yerelleştiricisinin hayvan ilk taramaları taşınmış olduğundan emin olmak için çalıştırılır. Deneyimlerimize göre, bu spektroskopik satın almalar için tekrarlanabilirlik ve doğruluk çok yüksek derecede sağlar. Son olarak, spektrumları, manyetik alan sürüklenme etkisini ortadan kaldırmak için ve son taramaları tekrarlanabilirlik ve kalitesini sağlamak için satın almalar arasındaki sistem frekans sıfırlama kısa bloklar halinde elde edilir. Satın alma sonunda, önceden tanımlanmış bir preamplifikatör kazanç tek bir darbe su spektrum, kantitatif bir sinyal genlik referans olarak kullanılır. Histoloji ve Blockface Görüntüleme: deneylerin zaman serisi son MRI tarama seanstan sonra, fare perfüze, beyin kaldırılır ve Hindistan bir damla mürekkep kullanarak karartılmış bir OCT blok, bileşik içine gömülü. Blok dilimleme ve histolojik analiz için bir Kriyostat yerleştirilir. Blockface görüntüler bir dijital fotoğraf makinesi (Canon EOS Digital Rebel 300D Canon Ultrasonik EFS 60mm f/2.8 Macro USM mercek) özel bir montaj Kriyostat önüne monte edilmiş ve uzaktan bir switch ile tetiklenen kullanarak elde edilir. Dijital görüntüler tüm beyin hacmi ile her 50 mikrometre elde edilir. Dilimler histolojik işleme ve boyama sonrası hacmi içinde kayıt izin numaralandırılır. Bireysel blockface dilimleri blok Kriyostat baş pozisyonu jitter hesap özetliyor kullanarak 3B hacim yeniden uyumlu hale getirilmiştir. Beyin hacmi daha sonra otomatik olarak analiz yazılım paketi (AnalyzeDirect, Lexena, KS) segmente kullanarak tohum tabanlı bölgedeki büyüyen algoritması. 5. Veri Analizleri SPIO algılama MRI kullanarak: SPIO T 2 ağırlıklı MRG sinyal kaybına neden olur doku SPIO varlığı gibi, MRG sinyal void duyarlıdır, ancak spesifik değildir işaretleyici. Duyarlılığı, 100 mikron izotropik çözünürlüğü ile tespit edilen tek bir mikron boyutlu parçacık, MRI ve SPIO parçacık boyutu mekansal çözünürlükte bağlıdır. Bu çalışmalarda, 200 nanometre ölçekli SPIO parçacıklar ile 150 mikron izotropik çözünürlük kullanılır. Beyinde SPIO varlığı için duyarlılık ve özgüllük sağlamak için, fare çıkarma görüntüleri daha sonra zaman noktalarında, beyin hücrelerinin pozitif tanımlanması için kullanılmak üzere izin SPIO etiketli hücrelerinin enjeksiyonu önce tarandı. 3D MRI taramaları daha önce 17 açıklandığı gibi laboratuvarda geliştirilen kısıtlı düzeyini ayarlamak yöntemi kullanılarak subimaged. Subimaged beyin hacimleri, daha sonra normalize sinyal yoğunluğu coregistered, ve birimleri, herhangi bir subpixel kayıt hataları, yanlış pozitif sinyal ortadan kaldırmak için kenarları boyunca sinyal kaybı (SPIO varlığı) ile beyin hacmi içinde bölgeleri tespit etmek için çıkarılır. Histoloji ve MRG Coregistration: Coregistration histoloji ve MRG arasındaki ortak bir referans olarak blockface görüntü kullanılarak gerçekleştirildi. Bu yaklaşım, doku dilim asimetrik büzülme hazırlanması sırasında düzeltme ve önceki çalışmaları 18,19 açıklandığı gibi iki boyutlu bir soruna boyaması büyük sorunun karmaşıklığını azaltır . Burada, beyinde SPIO içeren makrofajların MRG ve histoloji algılama MRG sinyal kaybı ve yüksek hassasiyette, histoloji 12 gösterdiği birkaç hücre hacmi beklenen bir abartı ile mükemmel mekansal korelasyon göstermiştir. Bu iki sinyalleri doğru co-lokalizasyon dilimleri orijinal şekilleri, histoloji coregistration ve çözgü doğruluğu bir ölçü sağlar. DTI faiz getirisi (ROI) Analizi Bölgesi: DTI taramaları genellikle determ anatomik bir ROI seçimi ile analiz edilirbelirli bir anatomik altyapı doku ortalama difüzyon özellikleri ine. Difüzyon ağırlıklı veri analizi, IDL (Interactive Data Language, ITT Visual Bilişim Çözümleri, Boulder, CO) önceden 15,20 açıklanan yazılmış özel programlar kullanılarak yapılmaktadır . D av = (λ 1 + 2 + λ 3) / 3 ve fraksiyonel anizotropi (FA), λ: Analizler tensör diffusivities haritaları (λ 1, 2, λ λ 3), ortalama yayınım (D av) üretir Enine (l ⊥ = (λ 2 + λ 3) / 2) ve boyuna (λ ll = λ 1) başka bir yerde 21 açıklandığı gibi difüzyon tensör bileşenleri elde edilmiştir. Haritalar inşa edildikten sonra, ROI'ler T 2 ağırlıklı MRG overlaid renkli kodlanmış λ 1 yönlülük haritalar çizilir. HIV fare modeli analiz için seçilen bölgelerden örnekler Şekil 1'de gösterilir. Spektroskopik Analizi: beyin 1 H MRS doruklarına katkıda bulunan metabolik bileşiklerin kantitasyonu eğri uydurma yöntemleri çok çeşitli kullanılarak belirlenir. Çeşitli eğri uydurma teknikleri geliştirilmiştir. Laboratuvarımızda, biz son spektrumuna katkıda bulunan bireysel metaboliti spektrumlarının doğrusal bir kombinasyonu jMRUI 23 sinyal işleme paketi bir süre etki uydurma yöntemi (QUEST) 22 kullanmaktayız . Biz potansiyel katkıda bulunan faktörler olarak 22 ayrı metabolitlerin bir temel kullanır. Temelinde spektrumları simüle ve bireysel metabolitleri çözümleri spektrumları kullanılarak kontrol edilir. Tek bir yelpazenin bir eğri uygun sonuç bir örnek Şekil 2'de gösterilmiştir. 6. Temsilcisi Sonuçlar DTI ve 1HMRS örnekler Şekil 1 ve 2'de gösterilmiştir. 1H-MRS 24-26 ve DTI 27 sonuç Ek örnekler önceki yayınlarda görülebilir. Preinjection T 2 örnekleri * sarı etiketli hücrelerinin yerini bir kaplama ile ağırlıklı MRG Şekil 3'te gösterilmiştir. Fare monositler kuyruk damar içine enjekte kökenli makrofajlar etiketli vardı. Beş gün sonra, T 2 ağırlıklı MRG satın alındı ​​ve yukarıda açıklandığı gibi, işlenmiş. Fare tespit fare monositler kökenli makrofajlar bir çizgi olarak görülür beyin, HIV ile enfekte insan makrofaj enjeksiyonu tarafından hazırlanmıştır. Önceki yayınlar 10,12 histoloji ile işaretli hücrelerin ve coregistration iki algılama daha fazla örnekler görülebilir . Şekil 1 DTI ölçümlerini analiz bölgelerde tasviri. Şekil 2. JMRUI sinyal işleme paketi QUEST kullanarak Spektroskopik uydurma. Şekil 3 fokal ensefalit ile periferik kan beyin bölgeye göç SPIO işaretli hücrelerin tespiti. T 2 Hücre pozisyonlar (sarı) kaplama temsilcisi dilim * metinde ayrıntılı olarak ağırlıklı MRG satın alma.