Registrierte Bioimaging von Nanomaterialien für Diagnostische und Therapeutische Überwachung

1. Einführung Die selektive Abgabe von Medikamenten und therapeutischen Makromoleküle (Peptide, Proteine ​​und Nukleinsäuren) auf zellulärer und Gewebe Standorte der aktiven Erkrankung und der laufenden mikrobiellen Infektionen werden pharmazeutische Reaktionen während Krankheit 1-3 verbessern. Eine besondere zelluläre Website ist die Makrophagen, die sowohl sehr mobil und Immunsystem mitreißend und ist eine konsequente Hauptziel für das Human Immunodeficiency Virus (HIV). 4 Wichtig ist, dass Makrophagen beteiligt Entzündung liegt auch ein breites Spektrum von Erkrankungen, degenerative, entzündliche, infektiöse gehören und Krebserkrankungen, und die Zelle Mobilität Krankheit Websites zugrunde liegt Fortschreiten der Gewebeverletzungen 5-9. Wichtig ist, dass die Verwendung von durch Blut übertragenen Makrophagen als Droge, Makromolekül-und Signal-Carrier neue Aufmerksamkeit für seine translationale Potential gewonnen. Allerdings ist eine deutliche Behinderung bei der Realisierung therapeutischen Potentiale der Blut-Hirn-Schranke (BHS) unter anderem Gewebe Barrieren, die undurchlässig für ein Spektrum von Makromolekülen und Proteinen. Diese, Barrieren, dennoch tun erlauben Zellpassage. Insgesamt ist es prognostiziert, dass in den natürlichen Verlauf der Erkrankung peripherer Makrophagen, die Bypass-Barrieren formuliert Medikamente, Marker und Peptide zu den Orten der Infektion oder Entzündung tragen kann. Dennoch bleiben diese Technologien nur in der Entwicklung. Es ist durch unsere Arbeiten, die Zell-vermittelten Lieferung für diagnostische und therapeutische Anwendungen und solche Anwendungen entwickelt werden können werden durch Labor-und Tiermodellen menschlicher Krankheiten 10-12 unterstützt. 2. Nanomaterial Vorbereitungen Vorbereitung von Nanomaterialien für die Arzneistoff-Delivery und Biodistributionsuntersuchungen ist das Thema einer parallel Manuskript in dieser Ausgabe (Referenz parallel Manuskript). Alle Verfahren für kristalline Nanopartikel herstellen, sind in einer Sterilbank durchgeführt. Alle Flächen sind vor dem Gebrauch mit 70% igem Alkohol desinfiziert. Dies beinhaltet die Arbeit Oberfläche, das Äußere von Handschuhen und Verschüttetes. Alle sind mit der Lösung von replizieren 70% Alkohol sofort mit Tüchern abgedeckt. Handschuhe sind nach Gebrauch entsorgt und nicht getragen werden, wenn dabei ein anderes Labor-Bereich. Hilfsstoff, Drogen, steriles Wasser mit / mit / alle Reagenzien für die Herstellung von Wirkstoff-beladenen Partikel sind nur in Arbeitsbereichen gebracht, wenn Verfahren benötigt. Sterile verpackte Pipetten sind nur und verwendet anschließend vernichtet werden in eine biohazard Abfallbehälter. Die nasse bereit Apparat wird mit Alkohol vor und nach Gebrauch desinfiziert werden. Arbeitsbereich ist unmittelbar vor und nach mit 70% Alkohol gereinigt. Nanopartikel-Lösung ist für Pyrogen in Übereinstimmung mit FDA-Richtlinien getestet, um die Abwesenheit von bakteriellem Endotoxin in der Medikamentenentwicklung Partikel Lösungen für Tiere zu beurteilen. Kurz gesagt, Candidate Nanoformulierungen für in-vivo-Anwendung werden durch den Austausch des Medikaments Kern oder Tröpfchen mit einem identischen Größe Partikel-oder Frästeil von superparamagnetischen Eisenoxid (SPIO) vor der Beschichtung mit dem entsprechenden Tensid repliziert. Dies wird durch Maßnahmen der Größe, Ladung, Form und Zytotoxizität zu bestimmen, ob die SPIO Modellsystem die gleichen Eigenschaften wie der Kandidat nanoformulated Medikament hat gefolgt. Schließlich sind Zell-loading-Assays durch Inkubation mit dem Kandidaten SPIO Modell nanoformultation durchgeführt, um die Relaxivität innerhalb der Zellen mit Hilfe von Phantomen der markierten Zellen in Agar-Gel suspendiert sind zu bestimmen. Phantoms sind in dreifacher Ausfertigung erstellt und werden bei einer Reihe von Konzentrationen hergestellt, um die Relaxivität aufgrund der SPIO-Aufnahme in Zellen zu quantifizieren. Dies bietet einen Index der Empfindlichkeit und bestimmt, ob die Nanoformulierungen kann die Oxidationsstufe beeinflussen und damit die Sichtbarkeit der SPIO in der Kernspintomographie (MRI). 3. Methoden und Verfahren: Animal Vorbereitung Injektionen / Katheter. Je nach Zeitpunkt der Interesse hat, kann die Injektionen erfordern Verwendung eines Katheters an das Tier in der MRT zu injizieren. Die Katheter werden unter Verwendung eines nicht-magnetischen Nadel und einem Schlauch-Erweiterung mit minimalen Durchmesser um toten Raum in der Injektion zu minimieren. Der Katheter sollte entweder mit der Lösung mit dem Nanomaterial injiziert oder Kochsalzlösung, abhängig von der Totraum und die insgesamt akzeptablen Volumen der Injektion vorgefüllt werden. Wenn möglich, kann die Injektion mit einer physiologischen Kochsalzlösung gefolgt werden. Wenn akute mal nicht von großer Bedeutung, kann ein Pre-Scan durchgeführt werden, und die Injektion kann außerhalb des Magneten bei einer vorgegebenen Zeit durchgeführt werden, bevor die Follow-up-Scans für Bioverteilung Maßnahmen. Die Katheter werden in der Regel in die Schwanzvene für IV-Injektionen eingesetzt. Anästhesie und Monitoring. Vor dem Scannen wird das Tier in eine Kammer gelegt auf die Anästhesie induzieren. Diese Kammer ist mit dem 1,5% Isofluran in 70% vorgefüllten nitrous Oxid-und 30% Sauerstoff, um den Beginn der Anästhesie in der Tier-Geschwindigkeit und minimieren den Zeitaufwand erforderlich, um sicherzustellen, dass das Tier nicht mehr aufwachen nach der Entnahme aus der Kammer. Sobald das Tier vollständig betäubt, wird das Tier aus der Kammer entnommen und in den stereotaktischen Halterung ausgestattet, um die Atemfrequenz und die Temperatur des Tieres zu überwachen, während weiterhin Versorgung während der Auf-Isofluran und Scannen. Tierhaltung und Überlegungen zu Einstellungen: Set-up umfasst Auge Schmiermittel gegen Hornhautgeschwüren schützen. Das Tier ist leicht mit Gaze umwickelt und die Gaze ist an Stelle geklebt, um den Wärmeverlust beim Scannen zu minimieren und eine positive Druck gegen die Atmung zu überwachen. Tierhaltung sind mit verstellbaren Zahnstangen ausgerüstet, so dass für vertikale und horizontale Ausrichtung des Kopfes. Dies ist besonders wichtig für die Hochfeld-MRT, wie Angulation des Kopfes in die kaudale-rostralen Richtung zusätzliche Schwierigkeiten mit Magnetfeld Inhomogenität durch magnetische Suszeptibilität führen wird. Magnetfeld-Inhomogenität ist schädlich für die hohe Qualität T 2 * MRI sowie 1 H Magnetresonanz-Spektroskopie (1 H MRS) und Magnetresonanz-Diffusions-Tensor-Bildgebung (DTI). Neben der richtigen Positionierung des Kopfes Winkel in die kaudale-rostralen Richtung sollte Drehungen des Kopfes in dem Maße, möglich ist vermieden werden. Unter Berücksichtigung der Rotation der Tierhalter in der Magnet einen Ausgleich für kleinere Rotationen, die von Tier zu Tier auftreten können. Dies kann durch sorgfältige Platzierung der Kopf und die Aufmerksamkeit auf die Winkelung vor dem Einsetzen des Tieres in das MRT-System minimiert werden. Kalibrierung und Shimming: Nachdem das Tier in die Halterung und die Oberflächenspule richtig auf den Kopf gestellt, ist die Ausgangslage des Tieres durch eine Echtzeit-eindimensionale Anzeige in der kaudalen-rostralen Richtung bestimmt. Signal ist die Gegend rund um die Oberflächenspule zum Empfang verwendet eingeschränkt, wodurch sich die Notwendigkeit für die Interpretation der beobachteten Welle bildet. Sobald die erste Position bestimmt wird, ist ein 3-Ebenen Localizer Bild ergriffen, um die genaue Position des Tieres in den Scanner zu bestimmen und die Bewegung auf die genaue Position für den Scan (s) von Interesse erforderlich ermöglichen. Dies wird durch Anpassung der Homogenität des Magnetfeldes oder "Shim" den Magneten gefolgt. Dies ist durch die Abbildung der Feldverteilung und Berechnung eines genau bestimmten räumlichen Korrektur der gemessenen Reaktionen aus einer Reihe von Elektromagneten oder "Shim-Spulen" innerhalb des Systems entwickelt, um die Feldhomogenität einstellen Basis getan. Shimming erfolgt über ein Multi-Gradienten-Echo-Sequenz-und Mapping-Software, die von Dr. Hetherington 13 entwickelt. Regionen der Homogenität in der Region von den einzelnen bildgebenden Verfahren untersucht abgestimmt. Sobald shimming abgeschlossen ist, können wir den Scan (s) Interesse von dem Tier zu erwerben. 4. Data Acquisition Hohe Auflösung T 2 * gewichteten MRT. Bioverteilung der SPIO, die Nanopartikel enthalten kann durch den Nachweis Regionen Signalverlust in hochauflösenden 3D T 2 * gewichteten MRT bestimmt werden. Die Region des Gehirns ist vom Localizer Scans bestimmt und vorgeschrieben auf dem Localizer Scans oder zusätzliche Scans nach Bedarf. AT 2 * gewichteten MRT-Untersuchung mit 150 micron isotrope Auflösung wird dann übernommen. Eine hochauflösende 3D-Gradienten erinnerte echo MRT der Maus Kopf erworben wird mit einem 25 mm Vogelkäfig Volumen Spule mit Aufnahme-Parameter von echo-Zeit = 5 ms, Repetitionszeit = 50 ms, 30% echo, Flipwinkel = 35 Grad, im Durchschnitt = 2, Sichtfeld = 20 x 20 x 20 mm mit einer Auflösung von 128 x 128 x 128 (Voxel size = 150 x 150 x 150 um 3), total Messzeit = 30 min. Diffusion Tensor Imaging (DTI): Diffusion Tensor Bilder sind quantitative Maßnahmen der Richtung und Größe der Diffusion von Wasser in den Zellen des Gewebes. Als Ergebnis ist die Phase des Signals sehr anfällig für Bewegung, da die Scans sensibilisiert oder "gewichtet" werden für die mikroskopische Wasser Bewegung. Als Ergebnis sind single shot Akquisitionen gewünscht, Phasenverschiebungen zwischen Akquisitionen von verursacht Signal Verschmieren zu verhindern, und Respiratory Gating erforderlich ist, um grobe Bewegung während Signalerfassung zu verhindern. Daher ist eine respiratorische gated Spin-Echo-Diffusions-gewichteten Echo-Planar-Imaging (EPI) MR-Sequenz verwendet wird. Wieder shimming Bereich der Scans ist sehr wichtig, da off-Resonanz-Effekte während der Evolution des Signals verursacht Fehlregistrierung der Signalfrequenz und damit Position in der Ebene des Bildes. EPI Erfassungsparameter umfasste 14 Scheiben, 200 KHz Bandbreite, 96 x 96 in der Ebene der Akquisition bis 256 x 256 Nullen aufgefüllt, und ein 0,5 mm Schichtdicke. Die Diffusion Kodierung verwendet wurde eine ausgewogene, rotations-invariant und wechselnder Polarität ikosaedrischen Schema (12 Richtunggen) 14,15. Das Codierungsschema wurde entwickelt, um zu reduzieren background-Diffusionsgradienten Kupplungen 16. Diffusion Gewichtung b-Faktor = 800 s mm -2, δ = 4 ms, Δ = 15 ms, Gdmax = 40 g / cm, 200 us Anstiegszeit, 7 Durchschnittswerte für b = 0 Erwerb, 3 im Durchschnitt für jedes b = 800 Kodierung Richtung, also insgesamt Messzeit von 20-40 min, abhängig von der Atemfrequenz. Lokalisierte 1 H Magnetic Resonance Spectroscopy (1 H MRS): 1 H MRS kann von Hirnregionen auf Bilder, die während der gleichen Sitzung Bildgebung erworben vorgeschriebenen eingeholt werden. Anatomische Standorte sind auf Bildern zu finden, um die Region von Interesse für den Erwerb von Spektren zu verschreiben. Sobald der Region identifiziert, Shim auf eine Region, passend zum Volumen der Akquisition durchgeführt, überprüft mithilfe einer lokalisierten Wasser Spektrum. Dann wird die Kraft des Wassers Unterdrückung Impulse optimiert sind, ist das Wasser Frequenz gemessen, um on-resonance Wasser-Signals zu gewährleisten, und einen kurzen Test Spektrum erworben wird, um die Qualitätskontrolle bieten. Wenn Spektren von unzureichender Qualität sind, sind System-Einstellungen, einschließlich Hochfrequenz (HF) Energie-und Shim-Einstellungen überprüft. Schließlich, wenn die Qualität noch nicht ausreicht, ist eine zweite 3-Ebenen Localizer ausführen, um sicherzustellen, dass das Tier nicht von der ersten Scans verschoben. In unserer Erfahrung, ist dies eine sehr hohe Reproduzierbarkeit und Genauigkeit für spektroskopische Akquisitionen. Schließlich werden die Spektren in kurzen Sätzen mit dem Zurücksetzen des Systems Frequenz zwischen Akquisitionen Auswirkungen der Magnetfeld Drift zu beseitigen und die Reproduzierbarkeit und Qualität des Endprodukts zu gewährleisten Scans erworben. Am Ende der Akquisition wird ein einzelner Impuls Wasser Spektrum an einer vordefinierten Vorverstärker gewinnen als quantitative Signalamplitude Referenz verwendet. Histologie und Blockface Imaging: Nach der letzten MRT-Sitzung in der Zeit Reihe von Experimenten, die Maus ist durchblutet, das Gehirn entfernt und eingebettet in einen Block von OCT, Verbindung, die abgedunkelten hat mit einem Tropfen Tusche. Der Baustein ist in einem Kryostaten zum Schneiden und histologische Analyse gelegt. Blockface Bilder aufgenommen mit einer Digitalkamera (Canon EOS Digital Rebel 300D mit Canon Ultrasonic EFS 60mm f/2.8 Macro USM Objektiv) montiert an der Vorderseite des Kryostaten mit einem benutzerdefinierten montieren und ausgelöst durch einen Remote-Schalter. Digitale Bilder werden alle 50 Mikrometern durch das gesamte Hirnvolumen erworben. Scheiben sind nummeriert, um Anmeldung im Volumen erlauben nach histologischen Verarbeitung und Färbung. Individuelle blockface Scheiben wurden ausgerichtet, um das 3D-Volumen mit dem Block skizziert zu berücksichtigen Jitter in der Position des Kryostaten Kopf zu rekonstruieren. Das Gehirn Volumen wird dann automatisch segmentiert Samens region growing-Algorithmus in der Analyse-Software-Paket (AnalyzeDirect, Lexena, KS). 5. Daten-Analysen SPIO-Erkennung mittels MRT: SPIO Ursachen Signalverlust in T 2 * gewichteten MRT, und als solche ist die MRT-Signal void ein sensibler, aber nicht spezifischer Marker für SPIO Präsenz im Gewebe. Die Empfindlichkeit ist abhängig von der räumlichen Auflösung der MRT und der Größe der SPIO Partikel, mit einem einzigen mikrometergroßen Teilchen mit 100 micron isotrope Auflösung erkannt. In diesen Werken werden 150 micron isotrope Auflösung mit 200 Nanometer großen SPIO Partikel verwendet. Um sowohl Sensitivität und Spezifität für das Vorhandensein von SPIO in Gehirn, wurden die Mäuse vor der Injektion der SPIO markierten Zellen gescannt, damit Subtraktion Bilder für eine positive Identifizierung der Zellen in das Gehirn zu späteren Zeitpunkten verwendet werden. 3D-MRI-Scans wurden subimaged mit der eingeschränkten Höhe set-Methode in unserem Labor entwickelt wie bisher 17 beschrieben. Subimaged Gehirne wurden dann koregistrierten, Signalintensität normalisiert, und die Volumina subtrahiert werden, um Regionen im Gehirn Volumen erkennen mit Signalverlust (Vorhandensein von SPIO), die nicht an den Rändern war, positive falsches Signal von jedem Subpixel-Registrierung Fehler zu beseitigen. Koregistrierung für Histologie und MRT: Koregistrierung zwischen Histologie und MRT wurde unter Verwendung der blockface Bild als gemeinsamer Bezugspunkt erreicht. Dieser Ansatz reduziert die Komplexität der das große Problem der Korrektur der asymmetrischen Schrumpfung von Gewebeschnitten während der Vorbereitung und Färbung, um ein zweidimensionales Problem, wie in unseren früheren Arbeiten 18,19 beschrieben. Hier haben MRT und Histologie Erkennung von SPIO mit Makrophagen im Gehirn hervorragende räumliche Korrelation gezeigt, mit einem erwarteten Überschätzung des Volumens durch den Verlust in MRT-Signal und eine größere Sensibilität für wenige Zellen durch Histologie 12 gezeigt. Genaue Co-Lokalisation dieser beiden Signale liefert ein Maß für die Genauigkeit der Koregistrierung und Verziehen der Histologie wieder auf den ursprünglichen Formen der Scheiben. Region of Interest (ROI) Analysen von DTI: DTI-Scans werden in der Regel durch die Wahl eines anatomischen ROI zu bestim analysiertine der durchschnittliche Diffusion Eigenschaften des Gewebes in einer bestimmten anatomischen Unterkonstruktion. Die Analyse der Diffusions-gewichteten Daten werden unter Verwendung benutzerdefinierter Programme in IDL (Interactive Data Language, ITT Visual Information Solutions, Boulder, CO), wie zuvor beschrieben 15,20 geschrieben. Analysen zu produzieren Karten des Tensors Diffusionskoeffizienten (λ 1, λ 2, λ 3), durchschnittlich Diffusivität (D av), wo: D av = (λ 1 + λ 2 + λ 3) / 3 und fraktionierte Anisotropie (FA), wobei: Quer (λ ⊥ = (λ 2 + λ 3) / 2) und längs (λ ll = λ 1) Komponenten der Diffusions-Tensor wurden wie an anderer Stelle beschrieben 21. Sobald die Karten aufgebaut sind, sind ROIs auf T 2-gewichteten MRT überlagert mit Farbe kodiert λ 1 Richtwirkung Karten gezogen. Beispiele für die Regionen für die Analyse in der HIV-Maus-Modell gewählt, sind in Abbildung 1 dargestellt. Spektroskopische Analyse: Die Quantifizierung der metabolischen Verbindungen, die zur den Gipfeln des Gehirns 1 H MRS wird mit einem aus einer Vielzahl von Kurvenanpassung Methoden. Eine Vielzahl von Kurvenanpassung Techniken entwickelt worden. In unserem Labor beschäftigen wir eine Zeit-Fitting-Methode (QUEST) 22 in der jMRUI 23 Signalverarbeitung Paket, das eine lineare Kombination der einzelnen Metaboliten-Spektren, die zur endgültigen Spektrum ist. Wir verwenden eine Basis von 22 einzelnen Metaboliten als mögliche Faktoren gesetzt. Die Basis-Spektren werden simuliert und überprüft mit Spektren von Lösungen der einzelnen Metaboliten. Ein Beispiel für eine Kurvenanpassung ergeben sich aus einem einzigen Spektrum ist in Abbildung 2 dargestellt. 6. Repräsentative Ergebnisse Beispiele für DTI und 1HMRS sind in den Abbildungen 1 und 2 dargestellt. Weitere Beispiele für 1H MRS 24-26 und DTI 27 Ergebnisse finden Sie in unserem früheren Veröffentlichungen zu sehen. Beispiele für Voreinspritzung T 2 * gewichteten MRT mit einer Überlagerung der Lage der markierten Zellen in gelb ist in Abbildung 3 dargestellt. Die Maus hatte beschriftet Monozyten abgeleiteten Makrophagen in die Schwanzvene injiziert. Fünf Tage später, T 2 * gewichteten MRT wurde erfasst und verarbeitet, wie oben beschrieben. Die Maus wurde durch Injektion von HIV-infizierten humanen Makrophagen in das Gehirn, die als eine Reihe von erkannt Maus Monozyten abgeleiteten Makrophagen gesehen wird vorbereitet. Weitere Beispiele für beide Detektion von markierten Zellen und Koregistrierung mit der Histologie kann in unseren bisherigen Publikationen 10,12 gesehen werden. Abbildung 1. Darstellung der Regionen für die DTI-Metriken analysiert. Abbildung 2. Spektroskopische Montage mit QUEST in der jMRUI Signalverarbeitung suite. Abbildung 3. Erkennung von SPIO-markierte Zellen wandern aus dem peripheren Blut in einer Hirnregion mit fokalen Enzephalitis. Zell-Positionen (gelb) Overlay Vertreter Scheiben von einem T 2 * gewichteten MRT Akquisition, wie in dem Text.