Geregistreerd BioImaging van nanomaterialen voor diagnostische en therapeutische monitoring

1. Introductie De selectieve aflevering van geneesmiddelen en therapeutische macromoleculen (peptiden, eiwitten en nucleïnezuren) om cellen en weefsels sites van actieve ziekte en continue microbiële infecties zal verbeteren farmaceutische antwoorden tijdens ziekte 1-3. Een bijzonder mobiele site is de macrofaag dat is zowel zeer mobiel en het immuunsysteem innemend en is een consistente de belangrijkste doelstelling voor het humaan immunodeficiëntie virus (HIV). 4 Belangrijk is ook macrofagen bezig ontsteking een breed scala van aandoeningen die degeneratieve, opruiend, infectieziekten onder meer ten grondslag ligt aan en vormen van kanker, en de cel mobiliteit van de ziekte ten grondslag ligt aan sites van de progressie van het weefsel blessures 5-9. Belangrijker is dat het gebruik van bloed gedragen macrofagen als drug, macromolecuul, en het signaal dragers kreeg recente aandacht voor zijn translationeel potentieel. Echter, een significante obstructie in het realiseren van therapeutische mogelijkheden is de bloed-hersen barrière (BBB), onder andere weefsels barrières die ondoordringbaar is voor een spectrum van macromoleculen en eiwitten. Deze, barrières, toch wel toestaan ​​cel passage. Alles bij elkaar verwachting is dat in het natuurlijke beloop van de ziekte perifere macrofagen die bypass barrières kunnen geformuleerd drugs, markers, en peptiden te voeren naar sites van een infectie of ontsteking. Toch dergelijke technologieën blijven alleen in ontwikkeling. Het is door onze werken die cel-gemedieerde levering kan worden ontwikkeld voor diagnostische en therapeutische toepassingen en dergelijke toepassingen worden ondersteund door laboratorium-en dierlijke modellen van menselijke ziekten 10-12. 2. Nanomateriaal Voorbereidingen De voorbereiding van nanomaterialen voor drug delivery en biodistributie studies is het onderwerp van een parallelle manuscript in deze kwestie (referentie parallel manuscript). Alle procedures voor kristallijne nanodeeltjes fabricage worden uitgevoerd in een laminaire stroming kap. Alle oppervlakken worden ontsmet zijn voordat zij gebruik met 70% alcohol. Dit omvat werkoppervlak, de buitenkant van de handschoenen en het morsen. Allen zijn bedekt met oplossing van repliceren 70% alcohol onmiddellijk met doekjes. Handschoenen worden verwijderd na gebruik en worden niet gedragen bij het betreden van een ander laboratorium gebied. Hulpstof, drugs, steriel water met / in met alle / alle reagentia voor de productie van drugs beladen deeltjes worden alleen gebracht werkgebieden wanneer dat nodig is voor de procedures. Steriel verpakte pipetten worden enkel gebruikt en weggegooid na gebruik in een biologisch gevaarlijk afval container. De natte bereid apparaat is gedesinfecteerd met alcohol voorafgaand aan en na gebruik. Werkgebied wordt onmiddellijk gereinigd vóór en na met 70% alcohol. Nanodeeltjes oplossing is getest op pyrogeen in overeenstemming met de FDA richtlijnen om de afwezigheid van bacteriële endotoxine in drugs deeltje oplossingen gebruikt voor dieren te beoordelen. In het kort, Kandidaat nanoformulations voor in-vivo gebruik worden gerepliceerd door het vervangen van de drug kern of druppel met een identieke grootte deeltje of gefreesd stuk superparamagnetische ijzeroxide (SPIO) voor het coaten met de juiste oppervlakte-actieve stof. Dit wordt gevolgd door maatregelen van de grootte, lading, vorm en cytotoxiciteit te bepalen of de SPIO modelsysteem dezelfde eigenschappen als de kandidaat nanoformulated drug. Tot slot zijn cel laden testen uitgevoerd door incubatie met de kandidaat-SPIO model nanoformultation om de relaxatie te bepalen binnen de cellen met behulp van fantomen uit gelabelde cellen gesuspendeerd in agar gel. Phantoms zijn opgesteld in drievoud en zijn bereid op een reeks concentraties om de relaxatie te wijten aan de SPIO opname in de cellen te kwantificeren. Dit zorgt voor een index van gevoeligheid en bepaalt of de nanoformulations kan de oxidatie toestand van invloed zijn, en dus de zichtbaarheid van de SPIO in magnetic resonance imaging (MRI) scans. 3. Methoden en procedures: Animal Voorbereiding Injecties / katheters. Afhankelijk van de tijd van belang, kan de injecties vereisen het gebruik van een katheter om het dier te injecteren in de MRI. Katheters zijn bereid met behulp van een niet-magnetische naald en een slangetje uitbreiding met minimum diameter om de dode ruimte in de injectie lijn te minimaliseren. De katheter moet worden ingevuld met ofwel de oplossing die het nanomateriaal te worden geïnjecteerd of zoutoplossing, afhankelijk van de dode ruimte en het totale aanvaardbaar volume van de injectie. Indien mogelijk, kan de injectie worden gevolgd met een fysiologische zoutoplossing te spoelen. Indien acute tijden zijn niet van zeer groot belang, kan een pre-scan worden uitgevoerd, en de injectie kan buiten de de magneet worden gedaan op een vooraf bepaalde tijd voor de follow-up scans voor biodistributie maatregelen. Katheters zijn meestal geplaatst in de staartader voor intraveneuze injecties. Anesthesie en monitoring. Voorafgaand aan het scannen, is het dier in een kamer geplaatst om anesthesie te induceren. Deze kamer is ingevuld met de 1,5% isofluraan in 70% nitrous oxide en 30% zuurstof, om het begin van de anesthesie bij het dier snelheid en het minimaliseren van de hoeveelheid tijd die nodig is om ervoor te zorgen dat het dier niet zal wakker worden na verwijdering uit de kamer. Zodra het dier volledig verdoofd, is het dier uit de kamer en geplaatst in de stereotactische houder uitgerust om de adem snelheid en de temperatuur van het dier te controleren, terwijl blijven isofluraan leveren tijdens de set-up en scannen. Houders van dieren en afstelling overwegingen: Set-up bestaat uit eye smeermiddel om te beschermen tegen het hoornvlies zweren. Het dier is licht omwikkeld met gaas en het gaas wordt vastgebonden op zijn plaats om warmteverlies te minimaliseren tijdens het scannen en om een ​​positieve druk ten opzichte van de ademhaling toezicht te houden. Animal houders zijn uitgerust met verstelbare tanden bars, waardoor verticale en horizontale uitlijning van de kop. Dit is vooral van belang voor een hoge veld MRI, als hoeking van het hoofd in de caudale-rostrale richting zal leiden tot extra moeilijkheden met het magnetisch veld inhomogeniteit als gevolg van magnetische susceptibiliteit. Magnetisch veld inhomogeniteit is schadelijk voor hoge kwaliteit T 2 * MRI als een H magnetische resonantie spectroscopie (1 H MRS) en magnetische resonantie Diffusion Tensor Imaging (DTI). Naast de juiste positionering van het hoofd hoek in het caudale-rostrale richting, moet rotaties van het hoofd worden vermeden in de mate dat haalbaar is. Rekening houdend met de rotatie van het dier houder in de magneet zal compensatie bieden voor kleine rotaties, die kunnen optreden van dier tot dier. Dit kan verder worden geminimaliseerd door een zorgvuldige plaatsing van het hoofd en aandacht voor de hoeking voorafgaand aan het plaatsen van het dier in het MRI-systeem. Kalibratie en shimming: Zodra het dier is in de houder en het oppervlak spoel juiste manier is geplaatst op het hoofd, is de eerste positie van het dier bepaald door een real-time eendimensionale uitlezing in de caudale-rostrale richting. Signaal is beperkt tot het gebied rond de oppervlakte spoel gebruikt voor de ontvangst, het beperken van de noodzaak voor de interpretatie van de waargenomen golfvormen. Zodra de eerste positie is vastgesteld, wordt een 3-vliegtuig localizer image genomen om de precieze positie van het dier in de scanner te bepalen en om te zorgen voor beweging om de precieze locatie nodig is voor de scan (s) van belang. Dit wordt gevolgd door aanpassing van de homogeniteit van het magnetisch veld of "vulplaten" de magneet. Dit wordt gedaan door in kaart brengen van het gebied distributie en de berekening van een nauwkeurig bepaalde ruimtelijke correctie op basis van gemeten respons van een reeks elektromagneten of "shim spoelen" binnen het systeem is ontworpen om het veld homogeniteit aan te passen. Shimming is bewerkstelligd met behulp van een multi-gradiënt echo sequentie en mapping software ontwikkeld door Dr Hetherington 13. Regio's van homogeniteit zijn afgestemd op de regio onderzocht door elk individu imaging methode. Zodra shimming voltooid is, kunnen we het verwerven van de scan (s) van interesse van het dier. 4. Data Acquisition Hoge resolutie T 2 * gewogen MRI. Biodistributie van SPIO met nanodeeltjes kan worden bepaald door het detecteren van de regio's van het signaalverlies in hoge resolutie 3D-T 2 * gewogen MRI. De regio van de hersenen wordt bepaald door de localizer scans en voorgeschreven op de localizer scans of bijkomende scans als dat nodig is. AT 2 * gewogen MRI-scan met 150 micron isotrope resolutie is dan verworven. Een hoge resolutie 3D-gradient herinnerd echo MRI-scan van de muis hoofd wordt verkregen met behulp van een 25 mm vogelkooi volume spoel met acquisitie parameters van echo tijd = 5 ms, herhaling tijd = 50 ms, 30% echo, flip hoek = 35 graden, gemiddelden = 2, gezichtsveld = 20 x 20 x 20 mm met een resolutie van 128 x 128 x 128 (voxel size = 150 x 150 x 150 micrometer 3), de totale acquisitie tijd = 30 minuten. Diffusion Tensor Imaging (DTI): Diffusion Tensor beelden zijn kwantitatieve metingen van de richting en de grootte van de diffusie van water in de cellen van het weefsel. Als gevolg hiervan, de fase van het signaal is zeer gevoelig voor beweging, als de scans zijn gevoelig of 'gewogen' voor microscopische water beweging. Als gevolg hiervan zijn single shot acquisities gewenst om faseverschuivingen tussen overnames te voorkomen waardoor het signaal vegen, en respiratoire gating is nodig om grove bewegingen te voorkomen tijdens het signaal overname. Daarom is een respiratoire gated spin-echo diffusie gewogen echo planar imaging (EPI) MR-sequentie is gebruikt. Nogmaals, vulplaten de regio van de scans is erg belangrijk, omdat off-resonantie-effecten tijdens de evolutie van het signaal oorzaken verkeerde registratie van het signaal frequentie, en dus positie in het vlak van het beeld. EPI acquisitie parameters waren onder meer 14 plakjes, 200 KHz bandbreedte, 96 x 96 in het vlak acquisitie zero-gevuld tot 256 x 256, en een 0,5 mm slice dikte. De gebruikte diffusie-codering was een evenwichtig, rotatie-invariant en wisselende polariteit icosaëder regeling (12 richtingties) 14,15. De codering regeling was bedoeld om achtergrond-diffusie gradiënt te verminderen koppelingen 16. Diffusie gewogen b-factor = 800 s mm -2, δ = 4 ms, Δ = 15 ms, Gdmax = 40 g / cm, 200 us stijgtijd, 7 gemiddelden voor b = 0 overname, drie gemiddelden voor elk b = 800-codering richting, voor een totale overname tijd van 20-40 min, afhankelijk van de ademhaling. Gelokaliseerde een H Magnetic Resonance Spectroscopy (1 H MRS): 1 H MRS kan worden verkregen bij gebieden van de hersenen voorgeschreven op beelden die tijdens dezelfde opnamesessie. Anatomische locaties zijn te vinden op de afbeeldingen om de regio van belang te schrijven voor het verwerven van spectra. Zodra de regio is geïdentificeerd, shimming wordt uitgevoerd op een regio die overeenkomen met de volume van de overname, gecontroleerd met behulp van een gelokaliseerde water spectrum. Vervolgens wordt de kracht van het water onderdrukking pulsen worden geoptimaliseerd, is het water frequentie gemeten om on-resonantie water-signaal te waarborgen, en een korte test spectrum is verkregen om de kwaliteitscontrole te bieden. Als spectra zijn van onvoldoende kwaliteit, zijn systeem instellingen, waaronder radiofrequente (RF) stroom en shim instellingen gecontroleerd. Tot slot, als de kwaliteit nog steeds onvoldoende is, wordt een tweede 3-plane localizer uitvoeren om ervoor te zorgen dat het dier niet is verhuisd van de eerste scans. In onze ervaring, biedt dit een zeer hoge mate van reproduceerbaarheid en nauwkeurigheid voor spectroscopische acquisities. Tot slot worden de spectra verworven in korte blokken met herinstelling van het systeem frequentie tussen acquisities effecten van magnetische veld drift op te heffen en reproduceerbaarheid en de kwaliteit van de uiteindelijke scans te verzekeren. Aan het einde van de overname, is een enkele puls water spectrum op een vooraf bepaald voorversterker gain gebruikt als een kwantitatieve signaal amplitude referentie. Histologie en Blockface Imaging: Na de laatste MRI-scan sessie in de tijdreeks van experimenten, de muis is doorbloed, de hersenen wordt verwijderd en ingebed in een blok van LGO, verbinding die werd verduisterd met behulp van een druppel Oost-Indische inkt. Het blok is geplaatst in een cryostaat voor het snijden en histologische analyse. Blockface beelden worden verkregen met behulp van een digitale camera (Canon EOS Digital Rebel 300D met een Canon EFS 60mm Ultrasonic f/2.8 Macro USM lens) gemonteerd aan de voorkant van de cryostaat met een aangepaste mount en uitgelokt door een externe schakelaar. Digitale beelden worden verworven om de 50 micrometer door het hele brein volume. Slices zijn genummerd om registratie mogelijk binnen het volume na histologische verwerking en vlekken. Individuele blockface plakjes werden afgestemd op de 3D-volume met behulp van het blok contouren om rekening te houden jitter in de positie van de cryostaat hoofd te reconstrueren. De hersenen volume wordt dan automatisch gesegmenteerd met behulp van zaad op basis van region growing algoritme in de Analyze softwarepakket (AnalyzeDirect, Lexena, KS). 5. Analyses van gegevens SPIO detectie met behulp van MRI: SPIO veroorzaakt signaalverlies in de T 2 * gewogen MRI, en als zodanig de MRI-signaal leegte is een gevoelig, maar niet specifiek marker voor SPIO aanwezigheid in weefsel. De gevoeligheid is afhankelijk van de ruimtelijke resolutie van de MRI-scan en de grootte van de SPIO deeltje, met een enkele micron deeltjes gedetecteerd met 100 micron isotrope resolutie. In deze werken, zijn 150 micron isotroop met een resolutie van 200 nanometer SPIO deeltjes gebruikt. Om zowel de sensitiviteit en specificiteit voor de aanwezigheid van SPIO in de hersenen, werden muizen voorafgaand gescand om de injectie van de SPIO gelabelde cellen te laten aftrekken beelden worden gebruikt voor positieve identificatie van de cellen in de hersenen op latere tijdstippen. 3D-MRI-scans werden subimaged het gebruik van de beperkte niveau in te stellen methode is ontwikkeld in ons laboratorium zoals eerder beschreven 17. Subimaged hersenen volumes werden vervolgens coregistered, signaalintensiteit genormaliseerd, en de volumes afgetrokken van de regio's te detecteren in de hersenen volume met signaalverlies (aanwezigheid van SPIO), die niet was langs de randen om positieve valse signaal van elke subpixel registratie fouten te elimineren. Coregistration van de Histologie en MRI: Coregistration tussen histologie en MRI werd uitgevoerd met behulp van de blockface beeld als een gemeenschappelijk referentiekader. Deze aanpak vermindert de complexiteit van het grote probleem van het corrigeren van de asymmetrische krimp van het weefsel plakjes tijdens de voorbereiding en vlekken op een tweedimensionaal probleem, zoals beschreven in onze vorige werken 18,19. Hier hebben MRI en histologie detectie van SPIO met macrofagen in de hersenen blijkt een uitstekende ruimtelijke correlatie, met een verwachte overschatting van het volume door het verlies in de MRI-signaal en een grotere gevoeligheid voor enkele cellen aangetoond door histologie 12. Nauwkeurige co-lokalisatie van deze twee signalen geeft een maat voor de nauwkeurigheid van coregistration en verdraaiing van histologie terug naar de oorspronkelijke vormen van de schijfjes. Regio of Interest (ROI) Analyses van de DTI: DTI scans worden meestal geanalyseerd door de keuze van een anatomische ROI te bepaald tenine de gemiddelde diffusie-eigenschappen van het weefsel in een bepaalde anatomische onderbouw. Analyses van de diffusie-gewogen gegevens worden uitgevoerd met aangepaste programma's geschreven in IDL (Interactive Data Language, ITT Visual Information Solutions, Boulder, CO) zoals eerder beschreven 15,20. Analyses produceren kaarten van de tensor diffusivities (λ 1, λ 2, λ 3), gemiddelde diffusiviteit (D av) waarin: D av = (λ 1 + 2 + λ λ 3) / 3 en fractionele anisotropie (FA), waarbij: Dwars (λ ⊥ = (λ 2 + λ 3) / 2) en longitudinale (λ ll = λ 1) componenten van de diffusie-tensor werden verkregen zoals beschreven elders 21. Zodra de kaarten zijn gebouwd, zijn ROI getekend op T-2 gewogen MRI bedekt met kleur gecodeerd λ een gerichtheid kaarten. Voorbeelden van de regio's gekozen voor analyse in het HIV-muis-model worden weergegeven in figuur 1. Spectroscopische Analyse: Kwantificering van de metabole stoffen die bijdragen tot de toppen van de hersenen van een H MRS is bepaald met behulp van een van een verscheidenheid van curve-fitting methoden. Een verscheidenheid aan curve fitting technieken zijn ontwikkeld. In ons laboratorium, gebruiken we een tijdsdomein passende methode (QUEST) 22 in de jMRUI 23 signaalverwerking pakket dat is een lineaire combinatie van individuele metaboliet spectra bij te dragen aan het uiteindelijke spectrum. We maken gebruik van een basis set van 22 individuele metabolieten als mogelijke factoren. De basis spectra zijn gesimuleerd en gecontroleerd met behulp van spectra van oplossingen van de afzonderlijke metabolieten. Een voorbeeld van een curve fit resultaat van een spectrum is weergegeven in figuur 2. 6. Representatieve resultaten Voorbeelden van DTI en 1HMRS worden getoond in figuren 1 en 2. Aanvullende voorbeelden van 1H MRS 24-26 en DTI 27 resultaten zijn te zien in onze vorige publicaties. Voorbeelden van preinjection T 2 * gewogen MRI met een overlay van de locatie van gelabelde cellen in geel is weergegeven in figuur 3. De muis had bestempeld monocyten afgeleid macrofagen geïnjecteerd in de staartader. Vijf dagen later, T 2 * gewogen MRI werd overgenomen en verwerkt zoals beschreven hierboven. De muis werd voorbereid door injectie van HIV geïnfecteerde menselijke macrofagen in de hersenen, die wordt gezien als een lijn van de gedetecteerde muis monocyten afgeleid macrofagen. Verdere voorbeelden van beide detectie van gelabelde cellen en coregistration met histologie kan worden gezien in onze vorige publicaties 10,12. Figuur 1. Voorstelling van regio's geanalyseerd voor DTI statistieken. Figuur 2. Spectroscopische fitting zoektocht in de jMRUI signaalverwerking suite. Figuur 3. Detectie van SPIO gelabelde cellen migreren uit het perifere bloed naar een gebied van de hersenen met focale encefalitis. Cel posities (geel) overlay vertegenwoordiger segmenten van een T 2 * gewogen MRI overname zoals beschreven in de tekst.