פיתוח מרקר לבחירה שלילי Entamoeba histolytica</em
Summary
אנו מדווחים על פיתוח של מערכת בחירה שלילית<em> א histolytica</em> מבוסס על ביטוי של חלבון מהונדס chimeric (FCU1) ובחירת עם prodrug 5-fluorocytosine. החלבון FCU1 הוא שילוב של דאמינז שמרים ציטוזין אורציל phosphoribosyltransferase. הביטוי של FCU1 הביא מוגבר<em> א histolytica</em> רגישות כלפי 5-fluorocytosine.
Abstract
Entamoeba histolytica הוא סוכן סיבתי של amebiasis ומדביק עד 10% מאוכלוסיית העולם. בטכניקות מולקולריות אפשרו למעלה ולמטה ויסות של ביטוי גנים להסתמך על transfection של פלסמידים נשמר ביציבות. בעוד אלה הגדילו את ההבנה שלנו של גורמים Entamoeba ארסיות, היכולת לשלב את ה-DNA אקסוגני לתוך הגנום, אשר תאפשר להפוך ניסויים גנטיקה, יהיה יתרון משמעותי במחקר של טפיל זה. האתגרים שהוצגו על ידי אורגניזם זה כוללים חוסר יכולת לבחור עבור הומולוגיים אירועי רקומבינציה וקושי לרפא DNA פלסמיד episomal מ trophozoites transfected. התוצאות מאוחר יותר ברקע גבוהה של DNA אקסוגני, בעיה מרכזית בזיהוי של trophozoites שבו אירוע בתום לב אינטגרציה הגנומי התרחשה. אנו מדווחים על פיתוח של מערכת המבוססת על סלקציה שלילית ביטוי מהונדס של דאמינז שמרים ציטוזין אורציל transferase phosphoribosyl הכימרה (FCU1) ובחירת עם prodrug 5-fluorocytosine (5-FC). האנזים ממיר FCU1 רעיל 5-FC לתוך fluorouracil-5 רעילים 5-fluorouridine-5'-monophosphate. E. קווי histolytica להביע FCU1 נמצאו 30 לקפל רגישים יותר prodrug לעומת זן הביקורת.
Protocol
Discussion
אמנם יש כבר התקדמות ניכרת כלים Entamoeba ביולוגי מולקולרי אין השיטות הקיימות זמין למחוק או לשבש גנים 4. מציאה של ביטוי גנים ספציפיים הושג על ידי שימוש RNAs מכבנה 5, קטן מפריע RNA 6 והביע bacterially dsRNA 7. אולם שיטות אלו תוך יעיל עבור גני מטרה בהתאמה, יש מספר מגבלות, כולל שימוש בכימיקלים יקרים, מבחר מתמשך נגד אנטיביוטיקה את הצורך באימות מתמדת עקב שכיחות גבוהה של חזרה המתרחשים לאורך זמן (אלישיה Linford, תקשורת אישית) 8.
הפלסמיד כל יכול לשכפל Entamoeba כפי שיש כנראה לא דרישה רצף קפדנית על מקורותיה של שכפול הדנ"א 9, transfected כך פעם, זה בדרך כלל קשה לרפא פלסמיד. זה מגביל את השימוש האפשרי של פלסמידים שלמים בניסויים רקומבינציה ואת הגן בנוקאאוט. סמני סלקציה שלילית הם רכיבי מפתח של גן מיקוד שיטות כפי שהם יכולים לשמש כדי לחסל subpopulations רקומביננטי. אנחנו הבענו בהצלחה קודון אופטימיזציה FCU1 גנים Entamoeba histolytica נבדק הפוטנציאל שלה כסמן לבחירה שלילית. היתוך גן זה שימש לטיפול גן התאבדות של תאים סרטניים אנושיים חילוף החומרים prodrug 5-FC למוצרים במורד רעילים וכתוצאה מכך עיכוב סינתזה של RNA-DNA 10. FCU1 שימש לאחרונה כסמן לבחירה שלילית Plasmodium, עוד טפיל protozoan. Plasmodium תאים berghei להביע FCU1 נמצאו 1000 כמעט פי רגישים יותר prodrug במבחנה טיפול vivo עם 5-FC נהרגו מעל 99.9% של הדבקה של טפילים רקומביננטי במודל האריתרוציטים בשלב העכבר של מלריה 11. E. תאים histolytica להביע FCU1 הראו רק רגישות פי 30 עלה ל prodrug 5-FC בניגוד רגישות שנצפתה פ berghei. הסיבות האפשריות לכך יכולה להיות מאגר גדול של נוקלאוטידים הזמינים בינוני הצמיחה מתחרים עם מטבוליטים רעילים.
בשני פ berghei ו פ falciparum סמן FCU1 נעשה שימוש שיבוש גנטי ממוקד. מחקרים 11,12. אנו שואפים לשנות את הגנום Entamoeba באמצעות הומולוגיים רקומבינציה. אימות של מערכת מבחר FCU1/5-FC השלילי הוא צעד משמעותי לקראת המטרה הזאת.
Disclosures
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
ברצוננו להודות לד"ר Erbs פיליפ לספק לנו את הרצף של הגן FCU1. עבודה זו נתמכה על ידי NIH מענק AI 26649.
Materials
| Material Name | Type | Company | Catalogue Number | Comments |
| TYI-S-33 medium | ATCC | Reference included in the text | ||
| 5-Fluorocytosine | Sigma | F7129 | ||
| Cell tracker green CMFDA | Invitrogen | C2925 | ||
| Spectra Max M2 plate-reader | Molecular Devices |
References
- Olvera, A. Stable transfection of Entamoeba histolytica trophozoites by lipofection. Arch. Med. Res. , 49-51 (1997).
- Saito-Nakano, Y., Yasuda, T., Nakada-Tsukui, K., Leippe, M., Nozaki, T. Rab5-associated vacuoles play a unique role in phagocytosis of the enteric protozoan parasite Entamoeba histolytica. J. Biol. Chem. 279, 49497-49507 (2004).
- Diamond, L. S., Harlow, D. R., Cunnick, C. C. A new medium for the axenic cultivation of Entamoeba histolytica and other Entamoeba. Trans. R. Soc. Trop. Med. Hyg. 72, 431-432 (1978).
- Clark, C. . Anaerobic parasitic protozoa : genomics and molecular biology. , (2010).
- Linford, A. S. Short hairpin RNA-mediated knockdown of protein expression in Entamoeba histolytica. BMC Microbiol. 9, 38-38 (2009).
- Solis, C. F., Guillén, N. Silencing genes by RNA interference in the protozoan parasite Entamoeba histolytica. Methods Mol. Biol. 442, 113-128 (2008).
- Solis, C. F., Santi-Rocca, J., Perdomo, D., Weber, C., Guillén, N. Use of bacterially expressed dsRNA to downregulate Entamoeba histolytica gene expression. PLoS ONE. 4, e8424-e8424 (2009).
- MacFarlane, R. C., Singh, U. Loss of dsRNA-based gene silencing in Entamoeba histolytica: implications for approaches to genetic analysis. Exp. Parasitol. 119, 296-300 (2008).
- Dhar, S. K., Vines, R. R., Bhattacharya, S., Petri, W. A. Ribosomal DNA fragments enhance the stability of transfected DNA in Entamoeba histolytica. J. Eukaryot. Microbiol. 45, 656-660 (1998).
- Erbs, P. In vivo cancer gene therapy by adenovirus-mediated transfer of a bifunctional yeast cytosine deaminase/uracil phosphoribosyltransferase fusion gene. Cancer Res. 60, 3813-3822 (2000).
- Braks, J. A. M., Franke-Fayard, B., Kroeze, H., Janse, C. J., Waters, A. P. Development and application of a positive-negative selectable marker system for use in reverse genetics in Plasmodium. Nucleic Acids Res. 34, e39-e39 (2006).
- Maier, A. G., Braks, J. A. M., Waters, A. P., Cowman, A. F. Negative selection using yeast cytosine deaminase/uracil phosphoribosyl transferase in Plasmodium falciparum for targeted gene deletion by double crossover recombination. Mol. Biochem. Parasitol. 150, 118-121 (2006).
