وضع علامة سلبية لإختيار a المتحولة الحالة للنسج</em
Summary
نحن تقرير وضع نظام اختيار سلبية في<em> E. نسج</em> استنادا إلى التعبير المعدلة وراثيا من البروتين خيالية (FCU1) والاختيار مع دواء مساعد 5 – فلوروسيتوزين. البروتين FCU1 هي عبارة عن اندماج نازعة أمين السيتوزين الخميرة واليوراسيل ناقلة الفسفوريبوزيل. نتج تعبير عن زيادة في FCU1<em> E. نسج</em> الحساسية تجاه فلوروسيتوزين – 5.
Abstract
المتحولة الحالة للنسج هو العامل المسبب لداء الأميبات وتصيب ما يصل الى 10 ٪ من سكان العالم. التقنيات الجزيئية التي مكنت من المتابعة وأسفل تنظيم التعبير الجيني الاعتماد على ترنسفكأيشن من البلازميدات حافظت بثبات. في حين أن هذه قد زادت من فهمنا للعوامل الفوعة المتحولة ، والقدرة على الاندماج في جينوم الحمض النووي الخارجية ، الأمر الذي سيسمح عكس التجارب علم الوراثة ، وسيكون ميزة كبيرة في دراسة هذا الطفيلي. التحديات التي يمثلها هذا الكائن الحي وتشمل عدم القدرة على تحديد للأحداث ، وصعوبة إعادة التركيب مماثل لعلاج DNA البلازميد episomal من النواشط transfected. النتائج في وقت لاحق على خلفية عالية من الحمض النووي الخارجية ، وهي مشكلة رئيسية في تحديد النواشط فيه بحسن نية الحدث التكامل الجينومية حدث. نحن تقرير وضع نظام اختيار سلبية على أساس التعبير المعدلة وراثيا من خميرة نازعة أمين السيتوزين واليوراسيل phosphoribosyl ترانسفيراز خيمر (FCU1) مع دواء مساعد واختيار 5 – فلوروسيتوزين (5 – FC). انزيم تحويل FCU1 غير سامة 5 – FC السامة في فلورويوراسيل – 5 و 5 ، 5' – fluorouridine الأدينوزين هاء. تم العثور على خطوط نسج معربا عن FCU1 ليكون 30 أضعاف أكثر حساسية للدواء مساعد مقارنة سلالة السيطرة.
Protocol
Discussion
وإن كانت هناك تقدما ملموسا في مجال البيولوجية الجزيئية الأدوات المتحولة لا توجد طرق الحالية المتاحة لحذف أو تعطيل الجينات 4. أحرز ضربة قاضية للتعبير جين معين عن طريق استخدام دبوس الشعر من RNAs 5 و 6 صغيرة بالتدخل RNA ، وأعرب عن البكتريا الرنا المزدوج الجديلة 7. لكن هذه الأساليب في حين فعالة للجينات الهدف منها ، والعديد من القيود بما في ذلك استخدام المواد الكيميائية مكلفة ، واختيار المستمرة ضد المضادات الحيوية وضرورة التحقق من صحة مستمر بسبب ارتفاع معدل حدوث انعكاس على مر الزمن (أليسيا ينفورد ، اتصال شخصي) 8.
يمكن لأي البلازميد في تكرار المتحولة كما أن هناك على ما يبدو ليس شرطا التسلسل الدقيق لأصول تكرار الحمض النووي 9 ، ومرة واحدة حتى transfected ، فإنه عادة ما يكون من الصعب علاج البلازميد. وهذا يحد من إمكانية استخدام البلازميدات سليمة في التجارب خروج المغلوب وإعادة التركيب الجيني. علامات التحديد السلبي هي المكونات الرئيسية لاستهداف الجينات والأساليب التي يمكن استخدامها للقضاء على المجموعات السكانية الفرعية المترابطة. أعربنا عنها بنجاح كودون الأمثل FCU1 الجينات المتحولة في نسج واختبار قدرته على اختيار علامة a سلبية. وقد استخدم هذا الانصهار الجين للعلاج بالجينات انتحار الخلايا السرطانية البشرية والتمثيل الغذائي للدواء مساعد 5 – FC في المنتجات السامة الناتجة المصب في تثبيط تخليق الحمض النووي الريبي و10. وقد استخدمت مؤخرا في FCU1 a علامة سلبية في اختيار المتصورة ، وآخر طفيلي ، وتم العثور على الخلايا المنجلية berghei FCU1 معربا عن أن ما يقرب من 1000 مرات أكثر حساسية للدواء مساعد في المختبر والمجراة في المعاملة مع نادي – 5 عن مقتل أكثر من 99،9 ٪ من اصابة الطفيليات المؤتلف في نموذج الفأر الكريات الحمر في المرحلة 11 من الملاريا. E. وأظهرت الخلايا نسج FCU1 فقط التعبير عن حساسية 30 ضعفا متزايدا لدواء مساعد 5 – FC على النقيض من الحساسية التي لوحظت في P. berghei. يمكن أن الأسباب المحتملة لهذا الأمر مجموعة كبيرة من النيوكليوتيدات المتاحة في وسط النمو تتنافس مع الأيضات السامة.
في كلا P. وberghei P. وقد استخدمت علامة FCU1 المنجلية في تعطيل الجينات المستهدفة. دراسات 11،12. ونحن نهدف إلى التلاعب في الجينات المتحولة باستخدام إعادة التركيب مثلي. المصادقة على نظام اختيار السلبية FCU1/5-FC يعد خطوة هامة نحو تحقيق هذا الهدف.
Disclosures
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
نود أن نشكر الدكتور فيليب Erbs لتزويدنا تسلسل FCU1 الجينات. وأيد هذا العمل من قبل المعاهد الوطنية للصحة منح منظمة العفو الدولية 26649.
Materials
| Material Name | Type | Company | Catalogue Number | Comments |
| TYI-S-33 medium | ATCC | Reference included in the text | ||
| 5-Fluorocytosine | Sigma | F7129 | ||
| Cell tracker green CMFDA | Invitrogen | C2925 | ||
| Spectra Max M2 plate-reader | Molecular Devices |
References
- Olvera, A. Stable transfection of Entamoeba histolytica trophozoites by lipofection. Arch. Med. Res. , 49-51 (1997).
- Saito-Nakano, Y., Yasuda, T., Nakada-Tsukui, K., Leippe, M., Nozaki, T. Rab5-associated vacuoles play a unique role in phagocytosis of the enteric protozoan parasite Entamoeba histolytica. J. Biol. Chem. 279, 49497-49507 (2004).
- Diamond, L. S., Harlow, D. R., Cunnick, C. C. A new medium for the axenic cultivation of Entamoeba histolytica and other Entamoeba. Trans. R. Soc. Trop. Med. Hyg. 72, 431-432 (1978).
- Clark, C. . Anaerobic parasitic protozoa : genomics and molecular biology. , (2010).
- Linford, A. S. Short hairpin RNA-mediated knockdown of protein expression in Entamoeba histolytica. BMC Microbiol. 9, 38-38 (2009).
- Solis, C. F., Guillén, N. Silencing genes by RNA interference in the protozoan parasite Entamoeba histolytica. Methods Mol. Biol. 442, 113-128 (2008).
- Solis, C. F., Santi-Rocca, J., Perdomo, D., Weber, C., Guillén, N. Use of bacterially expressed dsRNA to downregulate Entamoeba histolytica gene expression. PLoS ONE. 4, e8424-e8424 (2009).
- MacFarlane, R. C., Singh, U. Loss of dsRNA-based gene silencing in Entamoeba histolytica: implications for approaches to genetic analysis. Exp. Parasitol. 119, 296-300 (2008).
- Dhar, S. K., Vines, R. R., Bhattacharya, S., Petri, W. A. Ribosomal DNA fragments enhance the stability of transfected DNA in Entamoeba histolytica. J. Eukaryot. Microbiol. 45, 656-660 (1998).
- Erbs, P. In vivo cancer gene therapy by adenovirus-mediated transfer of a bifunctional yeast cytosine deaminase/uracil phosphoribosyltransferase fusion gene. Cancer Res. 60, 3813-3822 (2000).
- Braks, J. A. M., Franke-Fayard, B., Kroeze, H., Janse, C. J., Waters, A. P. Development and application of a positive-negative selectable marker system for use in reverse genetics in Plasmodium. Nucleic Acids Res. 34, e39-e39 (2006).
- Maier, A. G., Braks, J. A. M., Waters, A. P., Cowman, A. F. Negative selection using yeast cytosine deaminase/uracil phosphoribosyl transferase in Plasmodium falciparum for targeted gene deletion by double crossover recombination. Mol. Biochem. Parasitol. 150, 118-121 (2006).
