Sviluppo di un marcatore negativo selezionabile per Entamoeba histolytica</em

1. FCU sistema di selezione negativa in Entamoeba histolytica La linea di controllo vettoriale (HM1 / pKT3M) e la linea sperimentale (HM1/pKT3M-FCU1) sono stati generati da 1,2 tecniche descritte in precedenza. Seed le linee oggetto di studio dai tubi magazzino in T-25 palloni e mantenere la selezione con l'aggiunta di antibiotico appropriato (12 mg / mL G418) in TYI-S-33 3 media. I palloni devono essere del 70-80% confluenti dopo 16-18 ore di crescita a 37 ° C. Preparare una soluzione fresca magazzino 50mM di 5-fluorocytosine (5-FC, Sigma) nel warm TYI-S-33 di media. Vortex rigorosamente per alcuni minuti per sciogliere 5-FC completamente. Filtro-sterilizzare la soluzione madre facendola passare attraverso un filtro di 0,22 micron. Trofozoiti raccolta mettendo i palloni in ghiaccio per 3-5 minuti e raccogliere le cellule per centrifugazione a 200xg per 5 minuti a temperatura ambiente. Risospendere il pellet in acqua dolce di media TYI e contare le cellule. Progettazione di un tipico esperimento utilizza 0,5 x 10 4 cellule per pozzetto di una piastra da 48 pozzetti in un volume finale di 1 ml; e ripete tripla per ogni condizione di test. Inoltre, per facilitare le misurazioni fluorescente, un piatto a parte è usata per ogni ceppo per ogni punto del tempo. Semi di 0,5 x 10 4 cellule per pozzetto per ogni prova 5-FC concentrazione, in triplice copia. Mantenere la pressione antibiotica selezione nel medio TYI. Ora aggiungete la quantità necessaria di 5-FC soluzione madre e trofozoiti in ciascun pozzetto. Incubare le piastre in un sacchetto anaerobica a 37 ° C. 2. Determinazione della efficienza di selezione Preparare 2 mg / ml soluzione stock di Cell Tracker verde CMFDA (Invitrogen) in DMSO. Per rendere la soluzione di lavoro diluire lo stock di 1000 volte in mezzo privo di siero TYI. Rimuovere il supporto completamente da piastre di coltura trofozoite e sostituire con 150 microlitri di siero senza CMFDA TYI contiene. Continua incubazione a 37 ° C per 1 ora. Rimuovere la soluzione colorante da pozzi e leggere la piastra nella spettrofluorimetro Spectramax M2 micropiastre. La lunghezza d'onda di eccitazione deve essere impostata a 492 nm e l'emissione di fluorescenza leggere a 517 nm. Confrontare i valori di fluorescenza per le cellule di controllo rispetto al trasfettate prova. Continua a leggere le piastre a ogni intervallo di tempo. Usa positiva appropriata (TYI solo) e negativi (25 mg / ml Hygromycin) pozzetti di controllo in ogni piatto. 3. Rappresentante Risultati La E. trasfettate histolytica ha mostrato l'espressione solida di FCU1 codone ottimizzato ricombinante (Figura 1). Quando questo protocollo è seguita correttamente il risultato è l'eliminazione selettiva di E. cellule che esprimono histolytica FCU1 in presenza di 0,5 mM 5-fluorocytosine. Cellule di controllo, al contrario continuano a crescere normalmente fino a 5 mM concentrazione di 5-FC e raggiungere la confluenza tra il 72 e 96 ore (Figura 2-a). Il FCU1 cellule portando a 48 ore sono completamente lisati, quando i pozzi trattati sono visti al microscopio. Questi mostrano anche diminuito fluorescenza quando colorati con il colorante vitale CMFDA, che viene utilizzato negli studi quantitativi che coinvolgono gran numero di campioni (figura 2-b). Il sistema FCU1/5-FC è uno strumento efficace e potente selezione negativa per E. histolytica trofozoiti. Figura 1. Generazione di E. histolytica HM1 trasfettate che esprimono negativo marcatore (A) FCU1 proteina ricombinante è stato rilevato su un Western Blot con anticorpi anti-c Myc (pannello superiore). Come previsto, una band 42kDa poteva essere individuato (indicato da una freccia) nel lisato totale dal trasfettate FCU, ma non nel vettore solo trasfettate controllo. Il pannello in basso mostra la macchia stessa sondato con l'anticorpo contro l'actina come controllo di caricamento. (B) I risultati della PCR in tempo reale quantitativo mostrando FCU1 espressione di mRNA specifico normalizzato a lgl4 controllo. Figura 2. Sensibilità ai farmaci in vitro di E. trasfettate histolytica esprimendo negativo marcatore Curve di sopravvivenza di (a) trasfettate controllo e (b) trasfettate FCU1 esprimere coltivate in 48 pozzetti. Le cellule sono state coltivate in presenza di concentrazioni crescenti del profarmaco-5-fluorocytosine; la sopravvivenza delle cellule è stata quantificata colorazione CMFDA ad ogni intervallo di tempo indicato sulla X-asse. L'asse Y rappresenta unità fluorescenza ed è un riflesso diretto della popolazione di cellule sopravvissute. Si prega di notare che la FCU1 trasfettate che esprimono mostrato sensibilità significativa a concentrazione profarmaco 0,5 mm rispetto al controllo. Le cellule non sono stati osservati a punto temporale 120h in questi pozzi come comconfrontato alla crescita confluente visto in pozzetti di controllo corrispondente al microscopio (dati non riportati). Hygro denota 25μg / mL Hygromycin utilizzato come controllo negativo.