Поведенческая фармакология в классической Кондиционирование Ответ хоботок Расширение в Медоносные пчелы ( Apis Mellifera)

1. Ловля пчел из улья За день до эксперимента начинается, от 2 до 4 часов вечера, оставив пчелы улей ловят. Чтобы сделать это, ультрафиолетовый свет пропускает плексигласа пирамиды (высота = 30 см, вершиной 3,5 х 3, 5 см, основание 18 х 18 см), замыкаем на вершины и основания, проводится в 20 – 30 см, расстояние перед входом улей с базой открытых и закрытых вершине так, чтобы пчелы улей оставляя ввести основание пирамиды. База закрывается и захватили пчелы принесли в лабораторию для дальнейшей обработки. 2. Передача пчел от пирамиды в стеклянные флаконы В лаборатории, пирамиды находится на его основе. Стены пирамиды затемненной (например, с полотенцем), но вершиной остается открытым. Из-за их положительный фототаксис, пчелы оставят пирамиды через вершину при открытии. Один за другим пчелам передаются от пирамиды в стеклянные флаконы, держа флаконы над открытым вершине. Один флакон используется в пчелу. Таким образом, вершина закрыта, когда одна пчела входит флакон. 3. Использование пчел в трубах Пчелы иммобилизованных путем охлаждения их в стеклянных флаконах на льду в течение 2,5-3,5 мин. Желательно, чтобы посмотреть пчелу и удалить его из льда, как только он перестает двигаться. Одного иммобилизованного пчела запряженной в небольшой пластиковой трубкой с липкой лентой, так, что он может двигаться хоботок свободно, но не его голову, грудь и ноги. Важно, чтобы шея не сжимается. Каждая пчела зафиксирован в пластиковая трубка вводится в номер скважины на стойке для лучшей управляемости и идентификации. После того, как был удален для поиска кондиционирования или памяти трубки всегда возвращается в ту же самую скважину. 4. Кормление пчел В первый же вечер (4-6 часов), после поимки, пчелы кормятся на насыщение с раствором сахарозы (0,88 М, белого рафинированного сахара бытовой растворенных в водопроводной воде). Чтобы кормить пчел, его PER это вызвало, коснувшись его антенны с раствором сахарозы и животных разрешено потреблять одной капли (4 мкл) раствора сахарозы. Пчелы кормят один за другим, пока они больше не показывать быстрый и надежный PER, когда их антенны коснулась раствором сахарозы. На каждый последующий вечер (4-6 часов) эксперимента пчелы кормят один за другим четыре раза с 1 капли раствора сахарозы (4 мкл, 0,88 М, белого рафинированного сахара решена в водопроводной воде). Важно, чтобы раствор сахарозы не намазывается на антеннах пчелы или хоботок во время кормления и что трубы не загрязненных раствором сахарозы. Пчелы не должен питаться в или около кондиционирования сайта, чтобы исключить возможность привлечения к подготовке контексте с сахарозой стимул. 5. Хранение Конфекционированные Пчелы Ночь Пчел держат в течение ночи в пластиковой миске при комнатной температуре. Водопроводная вода заливается в миску (примерно 0,5-1 см в высоту). Стойки с запряженной пчелы помещаются в чаше над ватерлинией использованием ИФА пластин в качестве платформы. Наконец, чаша покрыта картоном. 6. Обонятельные кондиционирования В первое утро (10 часов) эксперимента обонятельных кондиционирования осуществляется. Условный раздражитель (ВС) запах, безусловного раздражителя (США) раствором сахарозы. 4 мкл запаха (например, гвоздичное масло) пипетируются на круглый бумажный фильтр (1,3 см в диаметре), который затем вставляется в 20 мл шприца. Запах пипеткой под капотом и фильтр советы используются для предотвращения загрязнения пипетки. Стойка с запряженной пчел находится рядом с кондиционирования сайт за 30 минут до процедуры кондиционирования запускается, но на расстояние до места в передней части выхлопной трубы, где одной пчелы обусловлены. Кондиционер состоит из трех пар запаха (условный раздражитель, CS) и раствором сахарозы (безусловного раздражителя, США, 1,25 М) в том следственном интервал (ITI) от 10 мин. Акустический сигнал доставляется экспериментатор через аудио-плеер обеспечивает точные сроки начала стимула, стимул смещение, длительности стимула и размещения. Приобретение суде начинается с 10 с размещением животных в передней части выхлопной трубы. Незадолго до конца 10 сек шприц, содержащий запах помещается 3 см от пчел, направленных на антеннах пчелы. Впоследствии запах представлен в течение 5 секунд, нажав 20 мл воздуха через шприц. После первых 3 сек дистальных жгутиков обеих антенн тронуты раствором сахарозы увлажненных зубочистку и животных разрешено лизать moistend зубочистку на 4 сек. 13 сек после стимуляции CS концов, пчелы изымаются из контекста и обучение вновь устанавливается в стойку. Всего один учебный судебный процесс длится 28 сек. Важно, что ни пчел, ни антенн хоботок покрыты сахарозой после кондиционирования. Поэтому оно должно быть обеспечено, что только зубочистка, смоченной раствором сахарозы и что ни капли раствора сахарозы форму на зубочистку. После кондиционирования стойки помещены обратно в миску. Поведение животных в ходе эксперимента, то есть возникновение PER во время размещения и CS и США презентации, контролируется и записал экспериментатором. 7. Запоминание Сохранение тесты могут быть выполнены в любом интервале (мин до нескольких дней). Стойка с пчелами, расположена рядом кондиционирования сайт за 30 минут до начала тестирования памяти. Тест памяти состоит из 5 сек CS презентации без предъявления США. Тест начинается с 10 сек размещения животных в передней части выхлопной трубы. Впоследствии запах представлен в течение 5 секунд, как описано выше. Поведение животных, т.е. появление PER во время размещения и презентации CS является записал во время эксперимента. В конце эксперимента ответ хоботок расширением снова вызвали прикосновением антенн с раствором сахарозы, чтобы животное все еще в состоянии расширить свой хоботок. 8. Системная инъекций Момент времени системных инъекций зависит от эксперимента. Маленькое отверстие сделано в кутикулы из задней части щитка рядом с трещиной scutal выше 17 полета мышцы с помощью одноразовой иглой подкожно (21 G). Использование стеклянных капилляра, 1 мкл раствора вводится через отверстие в кутикулы в полете мышцы. Обученные экспериментаторы могут придать одной пчелиной каждые 30 сек, позволяя точное время впрыска и кондиционирования. 9. Кормление пчел во время эксперимента На вечер (4-6 часов) после кондиционирования, пчелы кормят один за другим четыре раза с 1 капли раствора сахарозы (4 мкл, 0,88 М, белого рафинированного сахара, растворенных в водопроводной воде). Важно, чтобы раствор сахарозы не намазывается на антеннах пчелы или хоботок во время кормления и что трубы не загрязненных раствором сахарозы. Пчелы не должен питаться в или около кондиционирования сайта, чтобы исключить возможность привлечения к подготовке контексте с сахарозой стимул. 10. Сбор и анализ данных Появление ответа расширение хоботок в ходе эксперимента находится под контролем. Пчела забил положительной, если она распространяется хоботок между началом CS, и приводимые в США (во время обучения) или во время презентации CS (во время тестовой фазы), пересекая виртуальная линия между открытыми челюстями. Для включения в анализ животных, должны отвечать двум критериям: они должны выжить всего эксперимента они должны проявлять безусловное расширение хоботок ответа (PER) в растворе сахарозы в конце эксперимента. Процент пчел показывает PER во время приобретения и удержания тестов строится для каждой презентации CS. 11. Представитель Результаты: Два эксперимента представлены здесь. В первом эксперименте мы посмотрим на влияние системного введения фосфатно-солевом буфере (PBS, в мм: 137 NaCl, 2,7 KCl, 10,1 Na 2 HPO 4, 1,8 KH 2 PO 4, рН 7, 2) по обучению и долгосрочного формирования памяти. Три группы пчел были обучены с тремя CS-американских пар с между судом интервалом в 10 мин: необработанные группы, группы, которые вводили 1 мкл PBS 30 минут до тренировки, и липа вводили группе, получавшей так же, как PBS впрыском группы, но без инъекционных PBS. 24 ч после тренировки памяти тестировался с одной системе координат презентации во всех трех группах. Процент животных показывает условный рефлекс во время кондиционирования значительно возрастает во всех трех испытаниях обучения (рис. 1, ANOVA для повторных измерений для временной фактор F 2378 = 340 456, р <0,05). Никакой разницы в процентах можно было наблюдать между тремя группами во время кондиционирования (ANOVA для повторных измерений для фактор-группы F2, 189 = 1299, р> 0,05). Это справедливо для 24 часов удержания тест (F2, 187 = 0752, р> 0,05) при сравнении необработанных животных с PBS впрыском и фиктивными впрыском животных. Во втором эксперименте мы демонстрируем торможение сохранение данных в памяти трех-четырех дней после тренировки, когда синтез белка ингибитора anisomycin (10 мМ) системно вводят 30 мин после трех CS-американских пар. Сравнение anisomycin впрыском группы с PBS впрыском группа выявляет существенной разницы между группами во время удержания тEST (рис. 2, ANOVA для повторных измерений для фактор-группы F1, 94 = 8,86, р <0,05). Основное различие можно наблюдать на проверку памяти на 3 день и 4-й день. Это напоминает результаты Wüstenberg и соавт. 18 лет, которые также обусловлены пчел с тремя CS-американских пар, хотя и с другой протокол. Рисунок 1. Поражение кутикулы или инъекции PBS не меняет приобретение и сохранение данных в памяти. Животные были обучены с тремя CS-американских пар (приобретение). Через 24 ч, память была протестирована (Запоминание). За тридцать минут до тренировки, отверстие было сделано в кутикулы из двух групп (поражения, PBS) и одной из этих групп вводили 1 мкл PBS (PBS). Третья группа осталась без изменений (без лечения). Представлен процент животных для каждой группы в ответ на запах презентацию с PER. Дисперсионного анализа не выявили каких-либо существенных различий между группами в стадии приобретения (F2, 189 = 1,299, р> 0,05) или сохранение данных в памяти (F2, 187 = 0,752, р> 0,05). Рисунок 2. Инъекция anisomycin 40 минут после последнего CS-американских спаривания уменьшает сохранение данных в памяти три дня и четыре дня после тренировки. Животные были обучены с тремя CS-американских пар (приобретение) и вводят с 1 мкл 10 мМ anisomycin (Aniso) или 1 мкл PBS 1 ч после первого судебного процесса обучения. Память была проверена (Запоминание) 24 ч, 48 ч, 72 ч и 96 ч позже. Представлен процент животных в группе реагирования на запах презентацию с PER. Инъекция anisomycin приводит к значительному снижению сохранение данных в памяти 72 ч и 96 ч после тренировки (F1, 94 = 8,86, р <0,05), как показал ANOVA.