Farmacologia Comportamental no condicionamento clássico da Resposta Extensão Proboscis em Abelhas ( Apis mellifera)

1. Abelhas captura da Hive Um dia antes do experimento começa, entre 2 e 4 horas, deixando as abelhas da colméia são capturados. Para isso, uma pirâmide de luz UV plexiglass-permeável (altura = 30 cm, ápice de 3,5 x 3, 5 cm, base 18 x 18 cm), o que é que pode ser fechado no ápice e na base, é realizada em um 20 – 30 cm de distância na frente da entrada colmeia com a base aberta e fechada para o ápice que as abelhas saindo da colméia entrar na base da pirâmide. A base é fechada e as abelhas capturados são levados para o laboratório para manuseio. 2. Transferência Bees da pirâmide em frascos de vidro No laboratório, a pirâmide é colocado sobre sua base. As paredes da pirâmide estão escurecidos (por exemplo, com uma toalha), mas o ápice fica descoberto. Por causa de sua fototaxia positiva, as abelhas deixarão a pirâmide por meio do ápice quando aberto. Uma por uma, as abelhas são transferidas da pirâmide em frascos de vidro, mantendo os frascos sobre o ápice aberto. Um frasco é usado por abelha. Portanto, o ápice é fechado quando uma abelha entra no frasco. 3. Abelhas mobilização Tubes As abelhas são imobilizadas por refrigeração-los na frascos de vidro em gelo por 2,5-3,5 min. Aconselha-se a assistir a abelha e removê-lo do gelo, assim que pára de se mover. A única abelha imobilizado é aproveitada em um pequeno tubo de plástico com fita adesiva, de modo que é capaz de se mover livremente sua tromba, mas não a sua cabeça, tórax e pernas. É importante que o pescoço não é comprimido. Cada abelha fixo em um tubo de plástico é colocado em um furo numeradas em um rack para melhor manuseio e identificação. Depois de ter sido removido para a recuperação de condicionamento ou de memória do tubo é sempre retornado ao poço exatamente o mesmo. 4. Abelhas alimentação Na primeira noite (06/04 horas), depois de ser pego, as abelhas são alimentadas até a saciedade com solução de sacarose (0,88 M, o açúcar branco refinado doméstico dissolvido em água da torneira). Para alimentar uma abelha, seu PER é eliciada tocando suas antenas com a solução de sacarose e que o animal é permitido consumir uma gota (4 mL) da solução de sacarose. As abelhas são alimentadas uma após a outra repetidamente até que eles já não apresentam um PER rápido e confiável quando suas antenas são tocados com solução de sacarose. Em cada noite subseqüente (4-6 pm) das abelhas são alimentadas experimento uma após a outra quatro vezes com uma gota de solução de sacarose (4 mL, 0,88 M, açúcar branco refinado resolvido em água da torneira). É importante que a solução de sacarose não é espalhado em antenas da abelha ou da tromba durante a alimentação e que os tubos não estão contaminados com solução de sacarose. As abelhas não devem ser alimentados em ou perto do local condicionado para excluir a possibilidade de associar o contexto de formação com o estímulo de sacarose. 5. Mantendo abelhas Harnessed Overnight Abelhas são mantidas durante a noite em uma bacia de plástico em temperatura ambiente. Água da torneira é cheia na bacia (cerca de 0,5-1 cm de altura). Racks com as abelhas são colocadas aproveitado na bacia acima da linha d'água usando placas de ELISA como uma plataforma. Finalmente, a bacia é coberta com papelão. 6. Condicionado olfativa Na primeira manhã (10:00) do experimento de condicionamento olfativo é realizada. O estímulo condicionado (CS) é um odor, o estímulo não condicionado (EUA) é solução de sacarose. 4 mL do odor (óleo de cravo, por exemplo) são pipetados em um papel filtro rodada (1,3 cm de diâmetro) que é então inserido em uma seringa de 20 mL. O odor é pipetado sob um capuz e dicas de filtro são usados ​​para evitar a contaminação da pipeta. O rack com abelhas aproveitado é colocado próximo ao local 30 min condicionado antes do procedimento de condicionamento começa, mas a uma distância para o lugar na frente de um tubo de escape onde as abelhas só são condicionadas. Condicionamento consiste em três pares de odor (o estímulo condicionado, CS) e solução de sacarose (o estímulo incondicionado, EUA, 1,25 M) com um intervalo inter-ensaio (ITI), de 10 min. Um sinal acústico entregue ao pesquisador através de um leitor de áudio garante a data precisa de início do estímulo, estímulo offset, duração do estímulo e colocando. Um ensaio de aquisição começa com uma colocação de 10 segundos do animal na frente de um escape. Pouco antes do final do sec 10 a seringa contendo o odor é colocado 3 centímetros na frente da abelha orientadas para antenas da abelha. Posteriormente, o odor é apresentado durante 5 segundos, empurrando 20 mL de ar através da seringa. Após os primeiros 3 segundos do flagelos distal de ambas as antenas são tocados com uma solução de sacarose-umedecidos palito e animais estão autorizados a lamber o palito moistend por 4 seg. 13 seg após o término da estimulação CS, as abelhas são tomadas fora do contexto de formação e colocado de volta na prateleira. No total, um ensaio de treinamento dura 28 seg. É importante que nem antenas da abelha nem a tromba são cobertos com sacarose, após condicionamento. Por isso, tem que ser assegurado que o palito é apenas umedecido com solução de sacarose e que nenhuma gota de forma sacarose solução no palito. Após o condicionamento dos racks são colocados de volta na tigela. Comportamento dos animais durante o experimento, ou seja, a ocorrência do PER durante a colocação e CS e apresentação dos EUA, é monitorado e anotadas pelo experimentador. 7. Retenção de memória Testes de retenção pode ser realizada em qualquer intervalo de tempo (min até dias). O rack com abelhas é colocado perto do local condicionado min 30 antes do teste de memória começa. Um teste de memória consiste em 5 segundos sem apresentação CS apresentação EUA. O teste começa com uma colocação de 10 segundos do animal na frente dos gases de escape. Posteriormente, o odor é apresentado durante 5 segundos, como descrito acima. O comportamento do animal, ou seja, a ocorrência do PER durante a colocação ea apresentação CS é anotado durante o experimento. No final do experimento a resposta extention proboscis é novamente provocado tocando as antenas com solução de sacarose para garantir que o animal ainda é capaz de estender a sua tromba. 8. Injeção sistêmica O ponto de tempo de injeção sistêmica depende do delineamento experimental. Um pequeno buraco é feito na cutícula da parte posterior da rótula próxima à fissura scutal acima dos 17 músculos de vôo usando uma agulha hipodérmica descartável (21 G). Usando um tubo de vidro capilar, uma solução mL é injetado através do buraco na cutícula no músculo de vôo. Experimentadores treinados são capazes de injetar uma abelha cada 30 segundos, permitindo um calendário preciso de injeção e condicionamento. 9. Abelhas alimentação durante o Experimento Na noite (4-6 pm), após condicionamento, as abelhas são alimentadas uma após a outra quatro vezes com uma gota de solução de sacarose (4 mL, 0,88 M, o açúcar refinado branco dissolvido em água da torneira). É importante que a solução de sacarose não é espalhado em antenas da abelha ou da tromba durante a alimentação e que os tubos não estão contaminados com solução de sacarose. As abelhas não devem ser alimentados em ou perto do local condicionado para excluir a possibilidade de associar o contexto de formação com o estímulo de sacarose. 10. Coleta de Dados e Análise de Dados Ocorrência da resposta de extensão tromba durante o experimento é monitorado. A abelha é marcado positivo se estende a sua tromba entre o início do CS ea apresentação de os EUA (durante o treinamento) ou durante a apresentação CS (durante a fase de teste), cruzando uma linha virtual entre as mandíbulas abertas. Para ser incluído na análise de animais deve cumprir dois critérios: devem sobreviver todo o experimento e eles devem mostrar a resposta de extensão incondicionada probóscide (PER) para solução de sacarose no final do experimento. A porcentagem de abelhas mostrando o PER durante a aquisição e testes de retenção é plotado para cada apresentação CS. 11. Resultados representativos: Dois experimentos são apresentados aqui. No primeiro experimento olhamos para o impacto da injeção sistêmica de tampão fosfato (PBS, em mM: NaCl 137, KCl 2,7, 10,1 Na 2 HPO 4, 1,8 KH 2 PO 4, pH 7, 2) na aprendizagem e no longo prazo a formação da memória. Três grupos de abelhas foram treinados com três CS-US pares, com um intervalo inter-teste de 10 min: um grupo não-tratado, um grupo que foi injetado com 1 mL PBS 30 min antes do treino, e um grupo sham-injetado tratados da mesma forma que o grupo PBS-injetada, mas sem injetar PBS. 24 h após a formação da memória foi testada com uma apresentação CS em todos os três grupos. A percentagem de animais que apresentem a resposta condicionada durante o condicionamento aumenta significativamente ao longo dos três ensaios de formação (Fig.1, ANOVA para medidas repetidas para o fator tempo F 2378 = 340,456, p <0,05). Nenhuma diferença no PER pode ser observada entre os três grupos durante o condicionamento (ANOVA para medidas repetidas para o fator de grupos F2, 189 = 1,299, p> 0,05). Isso vale para um teste de retenção de 24 h (F2, 187 = 0,752, p> 0,05) na comparação entre animais não tratados com PBS-injetado animais e sham-injetado. No segundo experimento, demonstramos a inibição da retenção da memória de três e quatro dias depois do treinamento quando o inibidor da síntese protéica anisomicina (10 mM) foi injetado sistemicamente 30 min depois de três CS-US emparelhamentos. Comparação de um grupo anisomicina-injetados com um grupo PBS-injetado revela uma diferença significativa entre os grupos durante a retenção de test (Fig.2, ANOVA para medidas repetidas para o fator grupo F1, 94 = 8,86, p <0,05). A grande diferença pode ser observada no teste de memória no dia 3 e dia 4. Isto assemelha-se os resultados de Wüstenberg et al. 18 anos, que também condicionada abelhas com três CS-US emparelhamentos, embora com um protocolo diferente. Figura 1. Lesão cutícula ou injeção de PBS não altera aquisição e retenção da memória. Animais foram treinados com três CS-US pares (aquisição). Após 24 h, a memória foi testada (Retenção da Memória). Trinta minutos antes do treino, um buraco foi feito na cutícula dos dois grupos (lesão, PBS) e um desses grupos foram injetados com 1 mL de PBS (PBS). Um terceiro grupo foi deixada intacta (sem tratamento). Apresentada é a percentagem de animais para cada grupo responder a apresentação com um odor PER. Uma ANOVA não revelou diferenças significativas entre os grupos na fase de aquisição (F2, 189 = 1,299, p> 0,05) ou na retenção da memória (F2, 187 = 0,752, p> 0,05). Figura 2. Injeção de anisomicina 40 min após o emparelhamento CS-US última reduz a retenção de memória de três dias e quatro dias depois do treinamento. Animais foram treinados com três CS-US pares (aquisição) e injetados com 1 mL 10 mM anisomicina (Aniso) ou 1 mL de PBS 1 h após o julgamento primeira formação. Memória foi testada (Retenção da Memória) 24 h, 48 h, 72 he 96 h depois. Apresentada é a porcentagem de animais por grupo respondendo a apresentação com um odor PER. A injeção de anisomicina leva a uma redução significativa de memória de retenção de 72 h e 96 h após o treinamento (F1, 94 = 8,86, p <0,05), como revelado por uma ANOVA.