Summary

Sinapsi quantificare: un Immunocitochimica basato su analisi per quantificare Numero Synapse

Published: November 16, 2010
doi:

Summary

Questo protocollo dettagli come quantificare il numero delle sinapsi sia dissociato cultura neuronale e nelle sezioni cerebrali con immunocitochimica. Utilizzando vano anticorpi specifici, abbiamo etichetta terminali presinaptici così come i luoghi di specializzazione post-sinaptici. Si definiscono sinapsi come punti di colocalizzazione tra i segnali generati da questi marcatori.

Abstract

Uno degli obiettivi più importanti nel campo delle neuroscienze è quello di capire i segnali molecolari che istruire prime fasi della formazione di sinapsi. Come tale, è diventato imperativo per sviluppare approcci obiettivo di quantificare i cambiamenti nella connettività sinaptica. A partire dalla fissazione del campione, il presente protocollo come quantificare il numero delle sinapsi sia dissociato cultura neuronale e nelle sezioni cerebrali con immunocitochimica. Utilizzando vano anticorpi specifici, abbiamo etichetta terminali presinaptici così come i luoghi di specializzazione post-sinaptici. Si definiscono sinapsi come punti di colocalizzazione tra i segnali generati da questi marcatori. Il numero di questi colocalizations è quantificati tramite un plug-in puncta Analyzer (scritto da Bary Wark, disponibile su richiesta, c.eroglu cellbio.duke.edu @) sotto la piattaforma software di analisi ImageJ. Il dosaggio sinapsi descritte in questo protocollo può essere applicato a qualsiasi preparazione del tessuto neurale o della cultura per cui si è selettivo marcatori pre-e post-sinaptici. Questo test sinapsi è uno strumento prezioso che può essere ampiamente utilizzato nello studio dello sviluppo sinaptico.

Protocol

Soluzioni da preparare: Anticorpi buffer: 150 mM NaCl 50 mM Tris-Base (Fisher, Cat. No:. BP152-5, 50 mm) – 1,21 g BSA 1% (Sigma, Cat. No:. A2153, 1%) – 2,0 g 100 mM di L-lisina (Sigma, Cat. No:. L-1137, 100 mm) – 3,65 g Regolare il pH a 7,4 0,04% azide Regolare il volume a 200 ml con acqua distillata H 2 O. Filtrare con filtro 0.22μm (Millipore, Cat. No:. SCGPU02RE). PFA Diluant: …

Discussion

Il test sinapsi di cui sopra si basa nel contesto dei nostri obiettivi sperimentali, in cui ci si concentra in gran parte su proiezioni eccitatori di RGCs, sia in purificati cultura o nella sezione del cervello. Abbiamo fornito una tabella che elenca gli anticorpi di riferimento che funzionano bene per l'etichettatura sinapsi eccitatorie (Tabella 1).

Questo test sinapsi può essere adattata a quantificare il numero delle sinapsi neuronali di ogni popolazione o di qualsiasi altro sottotip…

Disclosures

The authors have nothing to disclose.

Acknowledgements

Nel laboratorio di A. Ben Barres (Stanford University).: Puncta Plug-in per immagini è stata scritta da Barry J Wark (Consulting Physion attuale indirizzo) Analyzer

Finanziamento;

  • Alfred P. Sloan Foundation
  • A. Esther e Giuseppe Klingenstein Fund, Inc.
  • Broad Fondazione per la Ricerca Biomedica
  • Cura per la malattia di Huntington iniziativa s

Materials

  Antigen Species Monoclonal/Polyclonal Vendor Catalog Number Dilution Works in Culture Works in Sections
Presynaptic Synapsin Rabbit Polyclonal Synaptic Systems 106004 1:750 Y N.D.
Synapsin Mouse Monoclonal Synaptic Systems 106001 1:500 Y Y
Bassoon Mouse Monoclonal Assay Designs VAM-PS003F 1:500 Y Y
Bassoon Guinea Pig Polyclonal Synaptic Systems 141004 1:1000 Y N.D.
Synaptotagmin 1 Rabbit Polyclonal Synaptic Systems 105002 1:750 Y N
Synaptobrevin 2
(C1.69.1)
Mouse Monoclonal Synaptic Systems 104211 1:500 Y Y
Synaptophysin
(C1.7.2)
Mouse Monoclonal Synaptic Systems 101011 1:500 Y Y
VGlut1 Mouse Monoclonal Millipore MAB5502 1:2500 N Y
VGlut1 Guinea pig Polyclonal Millipore AB5905 1:2500 N Y
VGlut2 Guinea pig Polyclonal Millipore AB2251 1:2500 N Y
Postsynaptic PSD-95
(6G6-1C9 clone)
Mouse Monoclonal Affinity Bio Reagents MA1-045 1:750 Y N
PSD-95 Rabbit Polyclonal Zymed 51-6900 1:500 N Y
Homer Mouse Monoclonal Synaptic Systems 160011 1:500 Y N.D.
Homer Rat Polyclonal Millipore AB5875 1:500 Y Y
Gephyrin Rabbit Polyclonal Synaptic Systems 147003 1:500 Y Y
Gephyrin Mouse Monoclonal Synaptic Systems 147 1:200 Y Y

Table 1: Lists examples of good pre- and postsynaptic markers that we have successfully utilized in our synapse assay. Be aware that this is not an exhaustive list of all available markers. Y = Yes, N = No, N.D. = Not Determined.

Reagent Company Cat. No.
PBS Invitrogen 20012-027
poly-d-lysine Sigma P6407
Laminin Cultrex 3400-010-01
Triton X-100 Roche Diagnostics Gmbh 9002-93-1
Normal Goat Serum Gibco 16210
VectaShield with DAPI Vector Laboratories H-1200
OCT Tissue-Tek 4583
Tris-Base (50 mM) Fisher BP152-5
Bovine Serum Albumin Sigma A2153
l-lysine Sigma L-1137
16% PFA solution Electron Microscopy Sciences 15711
Granular PFA Electron Microscopy Sciences 19210
24-well culture plate Falcon 35-3047
Goat anti-mouse Alexa conjugated antibodies Invitrogen
Supply Company Cat. No.
12mm, No. 0 glass coverslips Karl Hecht Gmbh 1105209
No. 1.5 glass coverslip (for slices) VWR Scientific 48393241
Glass slides VWR Scientific 48311-703

References

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Cite This Article
Ippolito, D. M., Eroglu, C. Quantifying Synapses: an Immunocytochemistry-based Assay to Quantify Synapse Number. J. Vis. Exp. (45), e2270, doi:10.3791/2270 (2010).

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