Summary

סינפסות כימות: Assay Immunocytochemistry מבוססי לכמת מספר סינפסה

Published: November 16, 2010
doi:

Summary

פרוטוקול זה מפרט כיצד לכמת את מספר הסינפסות הן בתרבות העצבית הפרידו בסעיפים המוח באמצעות immunocytochemistry. שימוש ספציפי תא נוגדנים, אנו תווית מסופי presynaptic כמו גם באתרים של התמחות postsynaptic. אנו מגדירים סינפסות כנקודות של colocalization בין האותות שנוצר על ידי סמנים אלה.

Abstract

אחת המטרות החשובות ביותר בחקר המוח היא להבין את הרמזים מולקולרית להורות כי בשלבים המוקדמים של היווצרות הסינפסה. ככזה זה הפך להיות הכרחי לפתח גישות אובייקטיבי לכמת שינויים קישוריות סינפטי. החל מ קיבעון המדגם, זה פרטים פרוטוקול איך לכמת את מספר הסינפסות הן בתרבות העצבית הפרידו בסעיפים המוח באמצעות immunocytochemistry. שימוש ספציפי תא נוגדנים, אנו תווית מסופי presynaptic כמו גם באתרים של התמחות postsynaptic. אנו מגדירים סינפסות כנקודות של colocalization בין האותות שנוצר על ידי סמנים אלה. מספר colocalizations אלה היא לכמת באמצעות תקע Puncta Analyzer (שנכתב על ידי Bary ווארק, זמין על פי דרישה, cellbio.duke.edu c.eroglu @) תחת פלטפורמת תוכנה לניתוח ImageJ. Assay סינפסה המתואר פרוטוקול זה יכול להיות מיושם על כל הכנה או רקמה עצבית תרבות שעבורו יש לך סמנים טרום postsynaptic סלקטיבית. זה assay הסינפסה היא כלי רב ערך אשר יכול להיות מנוצל באופן נרחב במחקר של התפתחות הסינפטי.

Protocol

פתרונות להכין: נוגדן חוצץ: 150 mM NaCl 50 מ"מ טריס-Base (פישר, החתול לא:. BP152-5, 50 מ"מ) – 1.21 גרם 1% BSA (Sigma, חתול לא:. A2153, 1%) – 2.0 ג…

Discussion

Assay סינפסה שתוארו לעיל מבוסס בהקשר של מטרות הניסוי שלנו, שבו אנו מתמקדים בעיקר על תחזיות מעוררות של RGCs, לא מטוהרים תרבות או בחלק המוח. סיפקנו שולחן התייחסות לרישום נוגדנים פועלות היטב עבור תיוג סינפסות מעוררות (טבלה 1).

Assay זה סינפס?…

Disclosures

The authors have nothing to disclose.

Acknowledgements

במעבדה של בן א בארס (אוניברסיטת סטנפורד).: Puncta Plug-in עבור תמונה J נכתב על ידי בארי ווארק (ייעוץ Physion הכתובת הנוכחית) Analyzer

מימון;

  • אלפרד פ 'סלואן קרן
  • אסתר א ויוסף Klingenstein קרן, Inc
  • רחבה מחקר ביו קרן
  • תרופה יוזמת מחלת הנטינגטון s

Materials

  Antigen Species Monoclonal/Polyclonal Vendor Catalog Number Dilution Works in Culture Works in Sections
Presynaptic Synapsin Rabbit Polyclonal Synaptic Systems 106004 1:750 Y N.D.
Synapsin Mouse Monoclonal Synaptic Systems 106001 1:500 Y Y
Bassoon Mouse Monoclonal Assay Designs VAM-PS003F 1:500 Y Y
Bassoon Guinea Pig Polyclonal Synaptic Systems 141004 1:1000 Y N.D.
Synaptotagmin 1 Rabbit Polyclonal Synaptic Systems 105002 1:750 Y N
Synaptobrevin 2
(C1.69.1)
Mouse Monoclonal Synaptic Systems 104211 1:500 Y Y
Synaptophysin
(C1.7.2)
Mouse Monoclonal Synaptic Systems 101011 1:500 Y Y
VGlut1 Mouse Monoclonal Millipore MAB5502 1:2500 N Y
VGlut1 Guinea pig Polyclonal Millipore AB5905 1:2500 N Y
VGlut2 Guinea pig Polyclonal Millipore AB2251 1:2500 N Y
Postsynaptic PSD-95
(6G6-1C9 clone)
Mouse Monoclonal Affinity Bio Reagents MA1-045 1:750 Y N
PSD-95 Rabbit Polyclonal Zymed 51-6900 1:500 N Y
Homer Mouse Monoclonal Synaptic Systems 160011 1:500 Y N.D.
Homer Rat Polyclonal Millipore AB5875 1:500 Y Y
Gephyrin Rabbit Polyclonal Synaptic Systems 147003 1:500 Y Y
Gephyrin Mouse Monoclonal Synaptic Systems 147 1:200 Y Y

Table 1: Lists examples of good pre- and postsynaptic markers that we have successfully utilized in our synapse assay. Be aware that this is not an exhaustive list of all available markers. Y = Yes, N = No, N.D. = Not Determined.

Reagent Company Cat. No.
PBS Invitrogen 20012-027
poly-d-lysine Sigma P6407
Laminin Cultrex 3400-010-01
Triton X-100 Roche Diagnostics Gmbh 9002-93-1
Normal Goat Serum Gibco 16210
VectaShield with DAPI Vector Laboratories H-1200
OCT Tissue-Tek 4583
Tris-Base (50 mM) Fisher BP152-5
Bovine Serum Albumin Sigma A2153
l-lysine Sigma L-1137
16% PFA solution Electron Microscopy Sciences 15711
Granular PFA Electron Microscopy Sciences 19210
24-well culture plate Falcon 35-3047
Goat anti-mouse Alexa conjugated antibodies Invitrogen
Supply Company Cat. No.
12mm, No. 0 glass coverslips Karl Hecht Gmbh 1105209
No. 1.5 glass coverslip (for slices) VWR Scientific 48393241
Glass slides VWR Scientific 48311-703

References

  1. Barres, B. A., Silverstein, B. E., Corey, D. P., Chun, L. L. Y. Immunological, morphological, and electrophysiological variation among retinal ganglion cells purified by panning. Neuron. 1, 791-803 (1988).
  2. Meyer-Franke, A., Kaplan, M. R., Pfrieger, F. W., Barres, B. A. Characterization of the signaling interactions that promote the survival and growth of developing retinal ganglion cells in culture. Neuron. 15, 805-819 (1995).
  3. Eroglu, C. Gabapentin receptor alpha2delta-1 is a neuronal thrombospondin receptor responsible for excitatory CNS synaptogenesis. Cell. 139, 380-392 (2009).
  4. Pfrieger, F. W., Barres, B. A. Synaptic efficacy enhanced by glial cells in vitro. Science. 277, 1684-1687 .
  5. Ullian, E. M., Sapperstein, S. K., Christopherson, K. S., Barres, B. A. Control of synapse number by glia. Science. 291, 657-661 (2001).
  6. Christopherson, K. S. Thrombospondins are astrocyte-secreted proteins that promote CNS synaptogenesis. Cell. 120, 421-433 (2005).
  7. Godement, P., Salaun, J., Imbert, M. Prenatal and postnatal development of retinocollicular projections in the mouse. J. Comp. Neurol. 230, 552-575 (1985).
  8. Schmidt, J. T. Formation of retinotopic connections: selective stabilization by an activity-dependent mechanism. Cell. Mol. Neurobiol. 5, 65-84 (1985).
  9. Sachs, G. M., Jacobson, M., Caviness, V. S. Postnatal changes in arborization patterns of murine retinocollicular axons. J. Comp. Neurol. 246, 395-408 (1986).
  10. Elmariah, S. B., Oh, E. J., Hughes, E. G., Balice-Gordon, R. J. Astrocytes regulate inhibitory synapse formation via Trk-mediated modulation of postsynaptic GABAA receptors. J. Neurosci. 25, 3638-3650 (2005).
  11. Hughes, E. G., Elmariah, S. B., Balice-Gordon, R. J. Astrocyte secreted proteins selectively increase hippocampal GABAergic length, branching and synaptogenesis. Moll. Cell. Neurosci. 43, 136-145 (2010).

Play Video

Cite This Article
Ippolito, D. M., Eroglu, C. Quantifying Synapses: an Immunocytochemistry-based Assay to Quantify Synapse Number. J. Vis. Exp. (45), e2270, doi:10.3791/2270 (2010).

View Video